流式细胞技术（Flow cytometry, FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物，它能有效地从单细胞水平区分异质性细胞群体，检测对象包括但不限于悬浮细胞、贴壁细胞或从实体组织分离的单细胞悬液和其他生物颗粒。

　　一、细胞表面染色步骤

　　1. 样本准备

　　①采集全血或组织（脾，淋巴结，胸腺和骨髓）用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)制成单细胞悬液。对于体外刺激的细胞，直接将刺激后的细胞悬浮在细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)中，然后进行第2步。

　　②加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS), 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。

　　2. 红细胞裂解

　　① 需裂解红细胞（如脾脏），将10x红细胞裂解液(ACK buffer)用去离子水稀释到1x，放置到室温。将细胞重悬于3mL的1x ACK buffer中，室温孵育3-5分钟；如不需要裂解红细胞，直接进入第3步。

　　②加入10mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)终止红细胞裂解，300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。

　　③重复洗涤一次，加满细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)至15mL, 300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。

　　④细胞计数，用细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)将细胞制成1x107/mL悬液。将100μL细胞悬液加入流式管中备用。

　　3. 封闭Fc受体

　　封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。

　　①小鼠中，纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入0.5-1μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体，室温孵育10分钟。

　　②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断，或者用商业化的Fc受体阻断剂。

　　4. 细胞染色

　　①按照说明书的推荐用量加入荧光标记的抗体，混匀后置于4℃，避光孵育30分钟。

　　②加入5 mL细胞染色buffer (或含0.1%BSA的PBS)重悬细胞，300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。

　　③加入0.5 mL细胞染色buffer(或含0.1%BSA的PBS)重悬细胞，用流式细胞仪进行检测和分析。

　　注意事项：

　　1.在抗体使用之前，快速离心一下，使之聚集到管的底部。

　　2.荧光标记的抗体应该避光4℃保存，不要冷冻。

　　3.当染色的时候，固定或延迟分析可能降低某些抗体的荧光信号。为了得到更好的结果，染色后应该马上分析。

　　二、细胞内细胞因子染色步骤

　　1. 细胞准备：

　　①收集细胞.经刺激和阻断处理的细胞（具体处理方案请参考文献进行）,加细胞染色buffer（或含0.1%BSA的PBS）制成单细胞悬液,调整细胞浓度约为1 × 107/mL。

　　②取100μL细胞/管（约1 × 106细胞),分别加到做好标记的流式管底部。

　　2. 固定：

　　①如需要表面染色,则先依照“细胞表面染色步骤”选用适宜抗体进行表面染色。

　　②用1×细胞固定/破膜液(Fixation/Permeabilization butter），将流式管中的细胞重悬，室温避光孵育30分钟

　　③300g离心5分钟，弃去上清。

　　3. 破膜：

　　①用1×细胞破膜（Permeabilization Buffer）将固定过的细胞悬起，300g离心5分钟,弃去上清。

　　②重复洗一次，300g离心5分钟，弃去上清。

　　③加入1mL的1×细胞破膜buffer(Permeabilization Buffer),4℃避光孵育30分钟；300g离心5分钟，弃去上清。

　　4. 胞内染色：

　　①用100μL的1×细胞破膜buffer（Permeabilization Buffer）重悬细胞,加入相应的抗体，混匀，4℃避光孵育至少30分钟。

　　②加入2mL的1×细胞破膜buffer（Permeabilization Buffer）重悬细胞,300g离心5分钟，弃去上清。

　　③加入2mL的细胞染色buffer（或含0.1%BSA的PBS）重悬细胞，300g离心5分钟,弃去上清。

　　④加入0.5mL的细胞染色buffer（或含0.1%BSA的PBS）重悬细胞,用流式细胞仪进行检测和分析。

　　注意事项:

　　1. 同一个细胞同时做细胞表面和细胞内的蛋白，建议先做细胞表面染色，再固定、破膜。

　　2. 细胞内染色推荐使用同型对照。