Westernblot 的实验基本原理：

　　本实验是对蛋白进行定性和半定量分析；

　　免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异；

　　将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离, 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下, 使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上, 并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等, 对抗原固定化基质膜进行检测和分析。

　　实验步骤概述：

　　1.样品的收集和制备；

　　2.电泳；

　　3.转膜；

　　4.封闭；

　　5.抗体的杂交反应；

　　6.蛋白检测，显色发光；

　　7.Western blot数据分析；

　　实验步骤和所用的试剂；

　　用Western blot进行蛋白表达的研究，实验主要分成三个步骤：第一步：样品的制备

　　1.样品收集及总蛋白提取

　　1）培养的细胞

　　细胞样品，若为贴壁细胞（细胞数量一般保证在1×106～1×107）先用预冷的PBS洗2~3次，之后加入含PMFS的强RIPA裂解液（约300ul），将细胞刮下，储存在离心管中；若为悬浮细胞，则先离心，去除上层培养液，再用预冷的PBS重悬，离心，重复操作2~3次，之后再加入RIPA裂解液，储存在离心管中；

　　2）动物组织

　　组织样品，取适量（250~500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含PMFS的强RIPA裂解液，用电动匀浆器进行破碎匀浆；

　　3）将加入裂解液后收集的样品，置冰上，裂解20~30min;

　　4)之后4℃,12000转，离心10min;

　　5)离心后，取上清，即为提取的总蛋白，将其保存在-80℃

　　第二步：对提取出的总蛋白，进行蛋白浓度的测定

　　按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作（Beyotime, P0010），测定样品浓度。

　　具体实验步骤如下：

　　1.取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。

　　2.取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20μl25mg/ml蛋白标准，加入980μl稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可以-20℃长期保存。

　　3.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5mlBCA试剂A加100μlBCA试剂B混匀，配制成5.1mlBCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定。

　　4.将标准品按0, 1, 2, 4, 8,12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20ul。

　　5.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。

　　6.各孔加入200μl BCA工作液,37℃放置20-30分钟。

　　（注:也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间）

　　7.测定A562nm(北京普朗酶标仪，DNM-9602)，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

　　第三步：以制备好的蛋白样本，进行SDS-PAGE相关实验

　　1.电泳(Electrophoresis)：

　　1）样品准备

　　取适量蛋白样品，加入5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，用漩涡振荡器(其林贝尔,QL-902)震荡混匀，之后离心，置于100℃或沸水浴加热5~10分钟，使蛋白充分变性，冷却到室温后，备用。

　　2) SDS-PAGE凝胶配制

　　根据检测的目的蛋白分子量配制合适浓度的SDS-PAGE凝胶；

　　3)上样与电泳

　　根据蛋白定量的数据以及目的蛋白表达峰度的强弱，计算合适的上样量，一般每孔30~60ug(本次实验通过预实验，最终加样量为40ug),把蛋白样品和预染蛋白marker直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内；加入电泳液，开始电泳，上层浓缩胶一般设置为恒压60V 30min ,下层分离胶一般设置为恒压120v 90min,通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

　　2.转膜(Transfer)

　　本实验采用传统的湿转法：

　　1）电泳结束后，将凝胶取下切割成合适大小，置于转膜缓冲液中浸泡5~10min（特别是一些小分子的蛋白，不要浸泡太久，以免蛋白扩散）；

　　2）膜处理：将预先裁剪好，和胶大小的虑纸以及NC膜或PVDF膜浸泡转膜缓冲液中至少10min，其中PVDF膜，要预先在甲醇中浸泡至少15S，之后放于蒸馏水整漂洗3~5分钟，最后再浸泡在转膜缓冲液中；

　　3）将胶，膜，虑纸，海绵垫，按顺序放好，置于转移装置中，加入转膜液，开始转膜,电源一般设置为恒流300mA,30~60min；

　　3.封闭(Blocking)

　　1）转膜完毕后，立即把蛋白膜放入到预先准备好的TBST洗涤液中，漂洗1-2min，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景.

　　2）将洗涤液吸去，加入Western封闭液（5％脱脂奶粉溶液），在摇床上缓慢摇动,室温封闭1h。（对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜）。

　　4.免疫反应（immunoreaction）

　　1）封闭结束后吸去封闭液，立即加入稀释好的一抗，在摇床上缓慢摇动室温孵育2h,(根据抗体说明书上建议稀释度以及预实验结果调整抗体浓度）;

　　2)孵育结束后，吸去一抗，加入TBST洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤10minX3次;

　　3)洗涤结束后，立即加入稀释好的HRP标记的二抗，在摇床上缓慢摇动室温孵育2h.（根据抗体说明书上建议稀释度以及预实验结果调整抗体浓度）;

　　4）孵育结束后，吸去二抗，加入TBST洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤10minX3次;洗涤后，备用。

　　5.蛋白检测(Detection of proteins)

　　将洗涤后的膜，用虑纸吸干表面洗涤液，立刻加上配制好的ECL试剂，进行化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影，曝光时间一般设置为5S~5min，根据蛋白发光强度，可以缩短或者延长曝光时间。将曝光显影后的胶片,用蒸馏水冲洗后，晾干，扫描，计算灰度值。

　　6.Westernblot结果分析（Data analysis）

　　用目的基因的灰度值，除以内参的灰度值，以校正误差，所得比值就是某样本中目的蛋白的相对表达量。

　　实验结果：