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手把手教你做实验——免疫组化(免疫组化实验操作步骤)

2022-10-31 10:23:28
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  免疫组化,即免疫组织化学技术,是一项利用抗原抗体反应,通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原,对蛋白定位、定性的实验技术。

  免疫组化实验操作步骤

  01、切片:

  包埋好的蜡块用切片机进行切片

  将切成的蜡带平铺在水浴锅中

  等待切片完全展开后有防脱载玻片轻轻将切片捞起,使其贴在载玻片上

  将载玻片放在切片架上

  02、烘片:70℃烘片30-40min

  03、脱蜡水化:将切片依次浸入以下溶液

  二甲苯Ⅰ15min

  二甲苯Ⅱ15min

  无水乙醇5min

  90%乙醇3min

  80%乙醇3min

  70%乙醇3min

  蒸馏水3min*3次

  PBS 3min*3次

  04、阻断内源性过氧化物酶:

  将3%过氧化氢倒入染色缸

  将切片放入染色缸中

  避光孵育20min

  将切片浸泡于PBS 3min*3次

  05、抗原修复:

  将柠檬酸钠稀释50倍

  将10mL的50x缓冲液中加入到1L的烧杯中,再加入490mL的蒸馏水,玻璃棒搅拌均匀

  用微波炉煮沸

  将组织切片放入烧杯中

  调至中火(P50),保温20min

  修复结束后,将烧杯拿出,烧杯和切片一同室温冷却至室温(注:不要将切片从烧杯中拿出)

  PBS 3min*3次

  06

  封闭:

  用吸水纸将组织周围的水小心吸干净

  用免疫组化笔在组织周围画圈以防止后续抗体流出

  在圈中滴加5%山羊血清封闭液至覆盖组织

  将切片平放于湿盒中,室温孵育30min

  07、一抗孵育:

  甩掉封闭液,滴加一抗使其覆盖组织

  放入湿盒中,4℃孵育过夜

  08、清洗:

  第二天取出湿盒后,室温复温30min

  回收一抗

  将切片依次浸入PBS 3min*3次,蒸馏水5min*2次

  09、二抗孵育:

  切片甩干水分并吸走水珠

  滴加二抗使其覆盖组织

  室温孵育120min或4℃孵育过夜

  10、DAB显色:

  将二抗回收至干净的1.5mL的离心管中

  用PBS浸洗切片3min*3次

  甩去多余的PBS

  在切片上滴加DAB显色液

  观察切片染色情况,棕黄色为阳性,染色明显即可用蒸馏水冲洗玻片终止显色

  11、复染细胞核:将切片置于苏木素中复染2min,细胞核变蓝色即可终止,并用自来水冲洗

  12、分化:将切片置于1%盐酸乙醇中分化5s,使组织由蓝色变成棕黄色,然后自来水冲洗3min

  13、脱水:将切片依次浸入以下溶液

  70%乙醇1min

  80%乙醇1min

  95%乙醇2min

  100%乙醇4min

  14、封片:切片铺平晾干后,滴加适量中性树胶封片


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