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关于动物细胞培养的几个问题(切取组织块是否需要无菌环境)

2022-06-15 10:29:36
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  动物细胞培养是动物细胞工程的基本技术,无论是动物细胞融合、细胞核移植,还是体外受精及胚胎移植都需要进行动物细胞培养,只不过培养的细胞类型有所差异而已。因此,动物细胞培养技术非常重要,但教材中对于操作技术并没有十分具体的指导,致使老师和同学都产生了各种错误的认识。这里根据自己在BDS教学时积累的相关资料,针对大家普遍关心的问题谈谈自己的看法。

  1.动物细胞培养的原则有哪些呢?

  无论培养何种细胞,也无论在上述的哪个工程中用到动物细胞培养,都要遵循下面四个基本原则:

  第一,无菌无毒害的环境:这里所说的无菌环境,是指在进行动物细胞培养时要尽量避免其它微生物的干扰,操作过程要注意无菌操作,具体如何达到无菌环境,下面专门介绍;所谓无毒害的环境,主要只是指避免细胞代谢产生的有毒物质积累而对细胞造成伤害,更换培养基是解决这一问题的主要方法,当然也要避免其它有毒物质的混入。

  第二,支持生长增殖的营养:主要指动物细胞培养基(培养液)。合适的细胞培养基既是体外细胞生长增殖的最重要的条件,为细胞提供营养和促使细胞生长增殖的基础物质,还为细胞生长和繁殖提供了生存环境。培养基的营养成分包括氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素、其它辅助物质。动物血清是细胞培养液中最重要的成分之一,含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分 。

  第三,其它类似体内的环境:是指温度、气体、渗透压、氢离子浓度(PH)及其他要与动物细胞所生活的内环境大致相同。

  第四,维持细胞性状:是指要通过尽早冻存原代细胞(动物细胞的保藏)、保持复苏后状态恢复的细胞以及转染后稳定存在的细胞性状、做实验的细胞要选对数生长期的细胞等措施维持这些细胞的性状,要防止细胞污染,如遇污染,及时处理等。

  2.如何排除微生物污染?

  微生物污染的类型很多,主要包括细菌污染、真菌污染、支原体污染、病毒污染和非同种细胞污染等类型,污染类型不同排除污染的方法也就不同。

  第一种方法:抗生素排除法:采用5~10倍于常用量的冲击法,加入高浓度抗生素后作用24~48h,再换入常规培养物,有时可能奏效。该方法主要针对常见的细菌污染。

  第二种方法:加温除菌:根据支原体不耐热的特点,可将受支原体污染的细胞置于41摄氏度作用5~10h(最长可达18h),以杀灭支原体。这种方法主要针对支原体污染。

  第三种方法:动物体内接种:受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔内,利用动物的免疫功能消灭污染的微生物,而肿瘤细胞却能在动物体内继续生长,待一定时间后从体内取出肿瘤细胞进行培养。

  第四种方法:与巨噬细胞共培养:巨噬细胞在体外可存活7~10天,并保持吞噬、消化微生物的能力。利用这一特点,可将少量的污染细胞与足够量的巨噬细胞共培养,从而消除污染。

  3.切取组织块是否需要无菌环境?

  多数人理所当然地认为切取组织块需要无菌环境,但这种认识是错误的。我们先看两个动物细胞培养的实例。

  第一个实例:组织块直接培养法(机械法)

  1、取材:将小鼠拉颈椎致死,置于75%酒精泡2—3秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部,将鼠带入超净台内解剖取肝脏,置平皿中。

  2、用Hank’s液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。

  3、用手术剪将肝脏剪成小块(1-2mm),再用Hank’s液洗三次,转移至小青霉素瓶中。

  4、将组织块转移到培养瓶,贴附于瓶底面。

  5、翻转瓶底朝上,将培养液加至瓶中,培养液勿接触组织块。入37℃静置3—5小时,轻轻翻转培养瓶,使组织浸入培养液中(勿使组织漂起),37℃继续培养。

  第二个实例:胰酶消化法

  1、取材:将小鼠拉颈椎致死,置75%酒精泡2—3秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部,将鼠带入超净台内解剖取肝脏,置平皿中。

  2、用Hank’s液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。

  3、用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2),再用Hank’s液洗三次,转移至小青霉素瓶中。

  4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20—40分钟,每隔5分钟振荡一次.

  5、加入2ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂),用吸管吹打,冲散细胞。

  6、静置,使未分散的组织块下沉。

  7、吸取上层细胞悬液,转移到两个培养皿中,补加适量培养液,37℃下培养。

  注:Hanks 液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液(Balanced Salt Solution,BSS ),简称H。主要用于配制培养液,稀释剂和细胞清洗液,而不能单独作为细胞组织培养液。

  可见,上述两种方法在取材时都没有提到无菌环境,仅仅要求一定的无菌操作,如置于75%酒精泡2—3秒钟、用碘酒消毒腹部、将鼠带入超净台内解剖取肝脏等。注意无菌操作(技术)与无菌环境是不同的概念。

  4.接触抑制和密度依赖抑制有何区别与联系?

  接触抑制是指细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂或移动的现象,接触抑制的产生的原因可能与细胞表面的糖蛋白之间的信息传递有关。例如,癌细胞细胞膜上的糖蛋白减少,也就丧失了接触抑制的特性,使癌细胞相互重叠形成肿瘤。接触抑制并非在细胞貼满容器壁时才发生,而是只要细胞相互接触就会出现停止分裂或移动,例如即使没有贴壁生长特性的细胞也会出现接触抑制的现象。而当细胞增殖到一定数量时,细胞之间就会争夺营养,同时排出的代谢废物就会对细胞产生毒害作用,而此时培养瓶的体积又是十分有限的,这样就会出现密度依赖抑制的现象,也就是密度过高抑制细胞增殖的现象,这种现象与种群数量变化中的密度限制因素是一个道理。可见,接触抑制并不像大家认为的当细胞铺满器壁时才出现接触抑制,反之,正是由于接触抑制才使正常细胞只能铺成一层,而不能相互重叠。接触抑制在动物细胞培养的整个过程都存在,而密度依赖抑制是当细胞增殖到一定浓度后才逐步显现出来。

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