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细胞如何冻存附带操作过程(细胞冻存步骤详解)

2022-09-19 10:22:00
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细胞如何冻存附带操作过程(细胞冻存步骤详解)

  1.什么是细胞冻存

  细胞长势良好,供大于求时,就可以考虑把细胞冻存起来,以后再用。当温度低于-70℃时,细胞内的酶活性全部停止,代谢活动停止,故可以达到长期保存的目的。冻存细胞时,随着温度降低,细胞内外的水分都会结晶,所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏,从而引起细胞死亡,特别是-20-0℃的阶段,冰晶呈针状,及容易引发细胞损伤。

  2.如何减少这种细胞内冰晶的损伤

  使用冷冻保护剂。常见的冷冻保护剂是甘油或二甲基亚砜(DMSO)。DMSO能快速穿透细胞膜进入细胞,降低冰点,延缓冻存过程,同时增加细胞膜的通透性,提高细胞内离子浓度,减少细胞内冰晶的形成,从而达到保护细胞的目的。

  要遵循“快速复苏,缓慢冻存”的原则。传统的做法是依次将细胞放入温度梯度降低的冰箱中,如4℃、-20℃、 -40℃、-80℃等。但这种方法比较麻烦,而且,步骤越多,越容易出错。所以可采用程序性冻存盒的方法,里面的异丙醇可以起到缓慢降温的作用,将其放入细胞冻存盒,可以实现一步到位的效果,再放入液氮中。

  3.细胞冻存前准备

  配制冻存液,一般为用培养液配制10% DMSO+90%FBS, 或者培养基:血清:DMSO=7: 2 :1

  4.冻存操作

  选择活力好,密度约80%的细胞,此时细胞处于对数生长期,最适合冻存。细胞冻存依旧分为贴壁细胞冻存和悬浮细胞冻存。

  显微镜下观察细胞状态,若细胞密度较高,培养基变黄,需要换液4h之后再进行冻存操作,细胞长满后,将培养皿中的培养基用枪小心的吸去,再PBS冲洗一到两次,尽量吸干净润洗的PBS,加入胰酶消化细胞,消化一定要注意控制胰酶作用时间,消化细胞时由于每个细胞贴壁性不一样,消化时间差别会很大,胰酶消化是需要比较精细的操作,既要充分消化下细胞打散成单细胞悬液,均匀接种,又要避免消化过度造成细胞严重受损。每个客户用的胰酶活力及消化步骤、试剂都是不一样的,不能完全规定消化时间,以客户经验为准。对于消化这步,客户如果对该细胞经验不多,无法准确掌控胰酶作用时间,建议客户按照下述操作:胰酶首先复温到室温后加入细胞,放入37℃培养箱,然后每隔30秒,即吹打下细胞,如果能够吹打散细胞(不能消化到细胞完全漂浮),说明细胞消化完成可以终止消化,细胞消化后,混匀细胞时尽量轻柔,不要产生过多气泡。如果30秒吹打不下,再等30秒重复操作。

  消化完成后加6-8ML完全培养基终止消化,混匀细胞,收集细胞悬液900-1000rpm离心3min,弃上清,加入配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml,在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者,装有细胞的冻存管装入厚壁泡沫盒中放入4℃冰箱10-30min ,然后连同泡沫盒放入-80℃冰箱中过夜,过夜后取出冻存管,移入液氮容器内。24h后取出一只冻存管复苏,检查活性及是否污染。

  5.注意事项

  细胞状态不好,密度过高或过低,培养液已经很黄;细胞可疑污染;细胞已经开始凋亡或崩解时不要急于冻存细胞,应尽量调整好细胞状态再冻存。

  冻存管的盖子一定要拧紧,否则复苏水浴时会渗水,造成污染。

  放在-80度冰箱的时间超过3个月,尽快转入液氮。

  定期测量液氮储备,保证细胞全部浸在液面下。

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