细胞如何冻存附带操作过程（细胞冻存步骤详解）

　　1.什么是细胞冻存

　　细胞长势良好，供大于求时，就可以考虑把细胞冻存起来，以后再用。当温度低于-70℃时，细胞内的酶活性全部停止,代谢活动停止,故可以达到长期保存的目的。冻存细胞时，随着温度降低，细胞内外的水分都会结晶,所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏，从而引起细胞死亡，特别是-20-0℃的阶段，冰晶呈针状，及容易引发细胞损伤。

　　2.如何减少这种细胞内冰晶的损伤

　　使用冷冻保护剂。常见的冷冻保护剂是甘油或二甲基亚砜(DMSO)。DMSO能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点,延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。

　　要遵循“快速复苏，缓慢冻存”的原则。传统的做法是依次将细胞放入温度梯度降低的冰箱中，如4℃、-20℃、 -40℃、-80℃等。但这种方法比较麻烦，而且，步骤越多，越容易出错。所以可采用程序性冻存盒的方法，里面的异丙醇可以起到缓慢降温的作用，将其放入细胞冻存盒，可以实现一步到位的效果，再放入液氮中。

　　3.细胞冻存前准备

　　配制冻存液，一般为用培养液配制10% DMSO+90%FBS, 或者培养基:血清:DMSO=7: 2 :1

　　4.冻存操作

　　选择活力好，密度约80%的细胞，此时细胞处于对数生长期，最适合冻存。细胞冻存依旧分为贴壁细胞冻存和悬浮细胞冻存。

　　显微镜下观察细胞状态,若细胞密度较高，培养基变黄，需要换液4h之后再进行冻存操作，细胞长满后，将培养皿中的培养基用枪小心的吸去，再PBS冲洗一到两次,尽量吸干净润洗的PBS，加入胰酶消化细胞,消化一定要注意控制胰酶作用时间，消化细胞时由于每个细胞贴壁性不一样，消化时间差别会很大,胰酶消化是需要比较精细的操作，既要充分消化下细胞打散成单细胞悬液，均匀接种，又要避免消化过度造成细胞严重受损。每个客户用的胰酶活力及消化步骤、试剂都是不一样的，不能完全规定消化时间，以客户经验为准。对于消化这步，客户如果对该细胞经验不多，无法准确掌控胰酶作用时间，建议客户按照下述操作：胰酶首先复温到室温后加入细胞，放入37℃培养箱，然后每隔30秒，即吹打下细胞，如果能够吹打散细胞(不能消化到细胞完全漂浮)，说明细胞消化完成可以终止消化，细胞消化后，混匀细胞时尽量轻柔，不要产生过多气泡。如果30秒吹打不下，再等30秒重复操作。

　　消化完成后加6-8ML完全培养基终止消化，混匀细胞，收集细胞悬液900-1000rpm离心3min，弃上清,加入配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml,在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者,装有细胞的冻存管装入厚壁泡沫盒中放入4℃冰箱10-30min ，然后连同泡沫盒放入-80℃冰箱中过夜，过夜后取出冻存管，移入液氮容器内。24h后取出一只冻存管复苏，检查活性及是否污染。

　　5.注意事项

　　细胞状态不好，密度过高或过低，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解时不要急于冻存细胞，应尽量调整好细胞状态再冻存。

　　冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。

　　放在－80度冰箱的时间超过3个月，尽快转入液氮。

　　定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。