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外泌体在疾病诊断与治疗上的应用方法

发布时间:2022-12-02 10:33:54 阅读:11342次 来源:百度学术

  外泌体是一种由活细胞分泌到细胞外环境的小囊泡,是细胞间信息传递的重要载体。外泌体携带大量特异性的蛋白质以及功能性的DNA、mRNAs、miRNAs等,在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程与多种疾病的发生和进程密切相关。外泌体的各个组分既可以当成疾病诊断的标志物,又可以作为疾病治疗的特异性靶点。接下来会重点介绍外泌体各个组分的功能与研究方向。

  什么是外泌体?

  大小:直径约30~140 nm,比微泡小;

  密度:密度约为1.13~1.19g/ml;

  结构:双层膜囊泡状结构小体;

  数量:人体中大约有1014个,平均每个细胞产生1000~10000个;

  细胞源:人体中几乎所有类型的活细胞均能产生外泌体;

  异质性:同一种细胞分泌的外泌体,也会存在功能区别;

  分布:外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中;

  外泌体产生于细胞中的多泡体。

  1.外泌体miRNA--疾病诊断的明星分子

  外泌体microRNA是目前研究最为广泛的小分子,因为相对于其他的DNA、lncRNA、tRNA等,外泌体miRNA最稳定,可以调节多个靶基因表达,而且miRNA也已经被证实可作为诊断多种疾病的标志物,可调节细胞分化、增殖、凋亡。

  比如研究发现外泌体的miRNA分子是心脏结节病的标志物【1】,外泌体miRNA全转录组测序鉴定多发性硬化症分子标志物【2】。2016年作者通过基因测序以及MTT试验等,识别分离自卵巢癌细胞和卵巢癌相关成纤维细胞(CAF)和脂肪细胞(CAA)外泌体中的差异miRNA,发现外泌体miR21通过靶向APAF1促进卵巢癌细胞产生耐药性,证明了miRNA调节卵巢癌细胞基因表达的作用机制。【3】

图例

  2.外泌体lncRNA--疾病诊断的标志物和治疗靶标

  目前外泌体循环RNA(lncRNA)已经成为早期癌症检测的有效分子标志物,以及早期癌症治疗的有效治疗靶点。2018年Molecular Cancer发表了一篇,作者通过分离早期胃癌患者和正常人的外泌体,首次通过lncRNA测序、外泌体lncRNA诊断能力分析等手段,筛选出外泌体lncRNA可以做为潜在的早期胃癌生物标志物【4】。除此之外,2019年EBioMedicine期刊上,作者发表了一篇关于外泌体circPTGR1可以降低miR449a–MET相互作用,破坏肿瘤细胞稳定性,有望可以作为肝癌的早期检测的标志物和治疗靶点。【5】

  3.外泌体tRNA--小身材大能量

  外泌体tRNA是一种主动的调控因子,参与细胞增殖与细胞分化过程,在乳腺癌、肝癌、胸腺等疾病中特异性表达,这种表达特异性与与许多疾病病理相关联,赋予tRNA更好的生物标志物潜力。四川大学魏霞蔚课题组于《Molecular Cancer》杂志发表文章,通过小RNA测序技术和分析健康人血浆和肝癌患者的外泌体tsRNA(tRNA衍生的小RNA)的水平差异,发现了肝癌患者血浆外泌体中四种tsRNA(tRNA-ValTAC-3、tRNA-GlyTCC-5、tRNA-ValAAC-5和tRNA-GluCTC-5)水平显著增加,揭示了血浆外泌体tsRNA可作为一种新型的肿瘤诊断分子标志物,奠定了外泌体tsRNA在肿瘤诊断中的潜在价值。【6】

  4.外泌体蛋白--疾病治疗的中枢系统

  近年来许多文献报道,前列腺癌细胞/肺癌细胞分泌的外泌体中富含多种蛋白质,促进肿瘤细胞的生长,是早期肿瘤诊断的有效途径。加利福利亚大学Robert Blelloch教授在《Cell》杂志,展示了外泌体PD-L1蛋白可以通过另一种机制抑制肿瘤增殖。作者通过比较两种肿瘤细胞分泌PD-L1蛋白水平的差异,发现外泌体中PD-L1可以抑制肿瘤生长,以及抑制淋巴T细胞的活化,成为肿瘤发展的主要调控因子,且抑制作用具有长期性。【7】

  除此之外,外泌体的脂类物质也是目前比较火热的研究对象,目前有很多研究表明,可以将脂类物质作为前列腺癌和肺癌的诊断和治疗的标志物。

  综上所述,外泌体不仅可以作为诊断多种疾病的生物指标,也可以作为治疗手段,未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗,是液态活检领域“三驾马车”之一

  5.外泌体相关FAQ

  目前翌圣生物公司提供的细胞上清/血清血浆外泌体提取试剂盒(货号:41201ES25和41202ES)可以快速从细胞培养上清中获得大量完整的外泌体颗粒,适用于下游的细胞共培养、电镜分析、Western Blot、荧光定量(qPCR)和高通量测序等应用。除此之外,还提供了高效且方便的外泌体鉴定试剂盒(货号:41203ES),适用于人、大鼠、小鼠外泌体的鉴定。

  在进行外泌体功能研究过程中,一般需要经过外泌体提取、纯化、鉴定、染色、测序等一系列的过程,提取的外泌体的量的多少,以及纯度的高低是实验成功与否的关键,下面将介绍一下外泌体提取过程中需要注意的细节。

  1. 不同样本提取外泌体参考体积?

图例

  2. 外泌体血液样本提取需注意事项?

  全血经过长时间放置,冷冻、离心、会发生溶血现象,无法提取外泌体,必须做好血清血浆的分离,以去除血清外源的外泌体。

  3.如何去除血清外源的外泌体。

  a.将细胞培养用的血清通过1×105g超速离心10h,去除血清外泌体;b. 选择无血清培养基进行细胞培养。

  4.细胞上清外泌体提取试剂盒(货号:41202)可以提取哪些样本的外泌体?

  细胞上清液、尿液(可直接提取)、脑脊液(需处理后再提取)。其他的组织液包括体液、唾液、卵泡液、精液等提取效率较低,建议客户用专门的组织液提取试剂盒。

  5.如何提取组织细胞外泌体?

  无菌环境下将组织剪成小块(越小越好),然后在无血清的培养基中培养12h;将培养液转移至离心管中,于4℃以3000g离心20 min去除培养液中杂质和细胞碎片,将上清液转移至新的离心管中;先使用0.45μm滤器过滤上清液,接着使用0.2μm滤器过滤上清液,再按照说明书提取外泌体。

  6.外泌体如何保存?

  纯化后的外泌体可于 4℃保存不超过一周,-80℃条件下可长期保存,避免反复冻融。

  6.相关文献

  【1】Crouser E D, Hamzeh N Y, Maier L A, et al. Exosomal microRNA for detection of cardiac sarcoidosis[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2017, 196(7): 931-934.

  【2】Selmaj I , Cichalewska M , Namiecinska M , et al. Global exosome transcriptome profiling reveals biomarkers for multiple sclerosis[J]. Annals of Neurology, 2017, 81(5).

  【3】Chi Lam Au Yeung, Ngai-Na Co1, Tetsushi Tsuruga1, et al. Exosomal transfer of stroma-derived miR21 confers paclitaxel resistance in ovarian cancer cells through targeting APAF1.NATURE COMMUNICATIONS. 2016.

  【4】Ling-Yun Lin, Li Yang, Qiang Zeng, et al. Tumor-originated exosomal lncUEGC1 as a circulating biomarker for early-stage gastric cancer. Molecular Cancer (2018) 17:84.

  【5】Wang G,Liu W,et al.Three isoforms of exosomal circPTGR1 promote hepatocellular carcinoma metastasis via the miR449a-MET pathway.EBioMedicine,2019.

  【6】Zhu L, Li J, Gong Y, Wu Q, Tan S, Sun D, Xu X, Zuo Y, Zhao Y, WeiYQ, Wei XW, Peng Y. Exosomal tRNA-derived small RNA as a promising biomarker for cancer diagnosis. Mol Cancer. 2019 Apr 2;18(1):74.

  【7】Poggio,M.,Hu,T.Y.,Pai,C.C.,Chu.B.,Belair,C.D.,Chang,A.,  Montabana,E.,Lang,U.E., Fu,Q., Fong, L., Blelloch, R.(2019).Suppression of Exosomal PD-L1 Induces Systemic Anti-tumor Immunity and Memory.Cell 177,414-427.


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