外泌体是一种由活细胞分泌到细胞外环境的小囊泡，是细胞间信息传递的重要载体。外泌体携带大量特异性的蛋白质以及功能性的DNA、mRNAs、miRNAs等，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。外泌体的各个组分既可以当成疾病诊断的标志物，又可以作为疾病治疗的特异性靶点。接下来会重点介绍外泌体各个组分的功能与研究方向。

　　什么是外泌体？

　　大小：直径约30~140 nm，比微泡小；

　　密度：密度约为1.13~1.19g/ml；

　　结构：双层膜囊泡状结构小体；

　　数量：人体中大约有1014个，平均每个细胞产生1000~10000个；

　　细胞源：人体中几乎所有类型的活细胞均能产生外泌体；

　　异质性：同一种细胞分泌的外泌体，也会存在功能区别；

　　分布：外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中；

　　外泌体产生于细胞中的多泡体。

　　1.外泌体miRNA--疾病诊断的明星分子

　　外泌体microRNA是目前研究最为广泛的小分子，因为相对于其他的DNA、lncRNA、tRNA等，外泌体miRNA最稳定，可以调节多个靶基因表达，而且miRNA也已经被证实可作为诊断多种疾病的标志物，可调节细胞分化、增殖、凋亡。

　　比如研究发现外泌体的miRNA分子是心脏结节病的标志物【1】，外泌体miRNA全转录组测序鉴定多发性硬化症分子标志物【2】。2016年作者通过基因测序以及MTT试验等，识别分离自卵巢癌细胞和卵巢癌相关成纤维细胞(CAF)和脂肪细胞(CAA)外泌体中的差异miRNA，发现外泌体miR21通过靶向APAF1促进卵巢癌细胞产生耐药性，证明了miRNA调节卵巢癌细胞基因表达的作用机制。【3】

　　2.外泌体lncRNA--疾病诊断的标志物和治疗靶标

　　目前外泌体循环RNA（lncRNA）已经成为早期癌症检测的有效分子标志物，以及早期癌症治疗的有效治疗靶点。2018年Molecular Cancer发表了一篇，作者通过分离早期胃癌患者和正常人的外泌体，首次通过lncRNA测序、外泌体lncRNA诊断能力分析等手段，筛选出外泌体lncRNA可以做为潜在的早期胃癌生物标志物【4】。除此之外，2019年EBioMedicine期刊上，作者发表了一篇关于外泌体circPTGR1可以降低miR449a–MET相互作用，破坏肿瘤细胞稳定性，有望可以作为肝癌的早期检测的标志物和治疗靶点。【5】

　　3.外泌体tRNA--小身材大能量

　　外泌体tRNA是一种主动的调控因子，参与细胞增殖与细胞分化过程，在乳腺癌、肝癌、胸腺等疾病中特异性表达，这种表达特异性与与许多疾病病理相关联，赋予tRNA更好的生物标志物潜力。四川大学魏霞蔚课题组于《Molecular Cancer》杂志发表文章，通过小RNA测序技术和分析健康人血浆和肝癌患者的外泌体tsRNA（tRNA衍生的小RNA）的水平差异，发现了肝癌患者血浆外泌体中四种tsRNA(tRNA-ValTAC-3、tRNA-GlyTCC-5、tRNA-ValAAC-5和tRNA-GluCTC-5)水平显著增加，揭示了血浆外泌体tsRNA可作为一种新型的肿瘤诊断分子标志物，奠定了外泌体tsRNA在肿瘤诊断中的潜在价值。【6】

　　4.外泌体蛋白--疾病治疗的中枢系统

　　近年来许多文献报道，前列腺癌细胞/肺癌细胞分泌的外泌体中富含多种蛋白质，促进肿瘤细胞的生长，是早期肿瘤诊断的有效途径。加利福利亚大学Robert Blelloch教授在《Cell》杂志，展示了外泌体PD-L1蛋白可以通过另一种机制抑制肿瘤增殖。作者通过比较两种肿瘤细胞分泌PD-L1蛋白水平的差异，发现外泌体中PD-L1可以抑制肿瘤生长，以及抑制淋巴T细胞的活化，成为肿瘤发展的主要调控因子，且抑制作用具有长期性。【7】

　　除此之外，外泌体的脂类物质也是目前比较火热的研究对象，目前有很多研究表明，可以将脂类物质作为前列腺癌和肺癌的诊断和治疗的标志物。

　　综上所述，外泌体不仅可以作为诊断多种疾病的生物指标，也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗，是液态活检领域“三驾马车”之一。

　　5.外泌体相关FAQ

　　目前翌圣生物公司提供的细胞上清/血清血浆外泌体提取试剂盒（货号:41201ES25和41202ES）可以快速从细胞培养上清中获得大量完整的外泌体颗粒，适用于下游的细胞共培养、电镜分析、Western Blot、荧光定量（qPCR）和高通量测序等应用。除此之外，还提供了高效且方便的外泌体鉴定试剂盒（货号：41203ES），适用于人、大鼠、小鼠外泌体的鉴定。

　　在进行外泌体功能研究过程中，一般需要经过外泌体提取、纯化、鉴定、染色、测序等一系列的过程，提取的外泌体的量的多少，以及纯度的高低是实验成功与否的关键，下面将介绍一下外泌体提取过程中需要注意的细节。

　　1. 不同样本提取外泌体参考体积？

　　2. 外泌体血液样本提取需注意事项？

　　全血经过长时间放置，冷冻、离心、会发生溶血现象，无法提取外泌体，必须做好血清血浆的分离，以去除血清外源的外泌体。

　　3.如何去除血清外源的外泌体。

　　a.将细胞培养用的血清通过1×105g超速离心10h，去除血清外泌体；b. 选择无血清培养基进行细胞培养。

　　4.细胞上清外泌体提取试剂盒（货号：41202）可以提取哪些样本的外泌体？

　　细胞上清液、尿液（可直接提取）、脑脊液（需处理后再提取）。其他的组织液包括体液、唾液、卵泡液、精液等提取效率较低，建议客户用专门的组织液提取试剂盒。

　　5.如何提取组织细胞外泌体？

　　无菌环境下将组织剪成小块（越小越好），然后在无血清的培养基中培养12h；将培养液转移至离心管中，于4℃以3000g离心20 min去除培养液中杂质和细胞碎片，将上清液转移至新的离心管中；先使用0.45μm滤器过滤上清液，接着使用0.2μm滤器过滤上清液，再按照说明书提取外泌体。

　　6.外泌体如何保存？

　　纯化后的外泌体可于 4℃保存不超过一周，-80℃条件下可长期保存，避免反复冻融。

　　6.相关文献

　　【1】Crouser E D, Hamzeh N Y, Maier L A, et al. Exosomal microRNA for detection of cardiac sarcoidosis[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2017, 196(7): 931-934.

　　【2】Selmaj I , Cichalewska M , Namiecinska M , et al. Global exosome transcriptome profiling reveals biomarkers for multiple sclerosis[J]. Annals of Neurology, 2017, 81(5).

　　【3】Chi Lam Au Yeung, Ngai-Na Co1, Tetsushi Tsuruga1, et al. Exosomal transfer of stroma-derived miR21 confers paclitaxel resistance in ovarian cancer cells through targeting APAF1.NATURE COMMUNICATIONS. 2016.

　　【4】Ling-Yun Lin, Li Yang, Qiang Zeng, et al. Tumor-originated exosomal lncUEGC1 as a circulating biomarker for early-stage gastric cancer. Molecular Cancer (2018) 17:84.

　　【5】Wang G,Liu W,et al.Three isoforms of exosomal circPTGR1 promote hepatocellular carcinoma metastasis via the miR449a-MET pathway.EBioMedicine,2019.

　　【6】Zhu L, Li J, Gong Y, Wu Q, Tan S, Sun D, Xu X, Zuo Y, Zhao Y, WeiYQ, Wei XW, Peng Y. Exosomal tRNA-derived small RNA as a promising biomarker for cancer diagnosis. Mol Cancer. 2019 Apr 2;18(1):74.

　　【7】Poggio,M.,Hu,T.Y.,Pai,C.C.,Chu.B.,Belair,C.D.,Chang,A.,  Montabana,E.,Lang,U.E., Fu,Q., Fong, L., Blelloch, R.(2019).Suppression of Exosomal PD-L1 Induces Systemic Anti-tumor Immunity and Memory.Cell 177,414-427.