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蛋白纯化分离的实验方法有哪些(蛋白纯化分离的实验总结)

2022-08-23 10:38:20
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  分离纯化方法已成为目前的研究热点之一。蛋白质的分离纯化工作较为复杂,从细胞中提取的蛋白质或从含有蛋白质的溶液中经过沉淀、梯度离心、盐析等方法得到的蛋白质经常含有杂质。要去除这些杂质,同时又要保持蛋白质的生物学活性,如酶的催化活性,就需要根据不同的蛋白质制定出相应的策略,采用不同的方法。

蛋白纯化分离的实验方法有哪些(蛋白纯化分离的实验总结)

  一、沉淀法

  1、盐析

  实验原理:中和蛋白质表面电荷并破坏水化膜。

  蛋白质易溶于水,因为其分子的-COOH -NH2和-OH都是亲水基团,这些基团与极性水分子相互作用形成水化层,包围于蛋白质分子周围形成1~100 nm大小的亲水胶体,从而削弱了蛋白质分子之间的作用力。当大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的 SO42- 和NH4+)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之"失水",于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。

  2、等电点沉淀法:

  实验原理:利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。在等电点时,蛋白质分子以两性离子形式存在,其分子净电荷为零(即正负电荷相等),此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥,分子相互之间的作用力减弱,其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀,所以蛋白质在等电点时,其溶解度最小,最易形成沉淀物。

  注意点:不同的蛋白质,具有不同的等电点。同一种蛋白质在不同条件下,等电点不同。

  3、有机溶剂沉淀法

  实验原理:加入有机溶剂使水溶液的介电常数降低,因而增加了两个相反电荷基团之间的吸引力,促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。

  有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似,有机溶剂与蛋白质争夺水化水,致使蛋白质脱除水化膜,而易于聚集形成沉淀。

  影响因素:(一)有机溶剂的选择 (二)温度的控制 (三)pH值 (四)离子强度。

  用此法析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降,分离后的蛋白质沉淀应立即用水或者缓冲液溶解,以达到降低有机溶剂的浓度的目的。此法在血液制品的制备过程中较多使用。

  二、层析

  1、离子交换柱层析

  实验原理:以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。是发展最早的层析技术之一,目前已成为蛋白质分离纯化最常用的手段,是基于蛋白质电荷不同的分离技术。

  离子交换层析中,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂;而带有负电荷的称之阳离子树脂。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以这类蛋白质被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

  2、疏水相互作用层析

  实验原理:根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。

  蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团,我们把这些疏水性基团称为疏水补丁,疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。不同的分子由于疏水性不同,它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同,疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。

  3、亲和层析

  实验原理:利用蛋白质能和某些专一分子可逆结合的特性,

  当蛋白质溶液通过层析柱时,其中可与亲和载体配基相互作用的受体被吸附剂结合,不被吸附的无关成分则可随流出液通过柱体,从而将吸附蛋白与其他蛋白质分开。此法特异性强,收率高。

  4、凝胶层析

  实验原理:根据分子大小分离蛋白混合物的最有效的方法之一。混合物随流动相流经装有凝胶固定相的层析柱时,其中各物质因分子大小的的不同而被分离的技术。

  三、离心

  1、速率区带离心法

  实验原理:根据分离的粒子在离心力作用下,因其在梯度液中沉降速度的不同,离心后具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内,形成几条分开的样品区带,达到彼此分离的目的。

  由于此法是一种不完全的沉降,沉降受物质本身大小的影响较大,一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。容量小,只能用于少量的制备。

  2、差速离心法

  实验原理:利用样品中各组分沉降系数的差异,对不同的微粒施以不同的离心力,经过多次离心,离心速度逐步加大,将不同的微粒依次沉降,从而实现离心分离。

  四、膜分离

  1、超滤法

  是利用加压膜分离技术,在一定的压力下,使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜,大分子溶质滞留,从而使大分子物质得到部分的纯化。常和离子交换,凝胶过滤联合使用。

  2、透析

  是利用小分子经过半透膜扩散到水( 或缓冲液) 的原理,将无机盐等小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术,常和盐析,盐溶等方法联合使用。

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