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什么是PCR,PCR应该了解的知识与实验出现问题的解决办法

2022-07-20 10:39:28
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  PCR是生物领域中最基础,也是尤为重要的一环今天给大家讲述一些PCR应该了解的知识与实验出现问题的解决办法

  首先给大家详细介绍下其原理

  PCR(Polymerase Chain Reaction)原理:

  即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

图例

  介绍了原理,少不了得说其几个重要体系成份

  1.模板(Template):基因组、质粒DNA、cDNA、也可以是细菌、组织样品等。

  2.引物(Primer):确定扩增目的序列打的特异性;确定扩增引物长度。

  3.DNA聚合酶(DNA Polymerase):推动PCR反应进行的机器。

  4.缓冲液(Buffer):控制体系的pH和离子,为DNA聚合酶提供最佳工作环境。

  5.脱氧核苷酸(dNTP):DNA的基本组成元件,包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。

  6.Mg、K离子增强剂。

  而我们在PCR实际操作过程中会遇到很多不可避免的问题,比如说:PCR产物条带拖尾,有杂带,更严重的是除了marker外,啥条带都看不到。

图例

  那我们应该如何有效的避免出现这些问题呢?首先得找出出现这些问题的原因,才能有效解决问题。常见的问题有很多种,但绝大部分能总结出以下几点。

  问题一:完全没有条带

  1.确认试剂是否存在质量问题或者加样时出错,导致反应体系不完整。2.检查模板DNA是否正确或者存在特殊结构,导致模板与引物无法结合。3.引物或反应温度设计不合理。

  问题二:有很多非特异性条带

  1.反应体系被污染。

  2.引物特异性差。3.退火温度不合适。

  问题三:目的条带弱

  1.聚合酶活性过低。

  2.循环次数偏低。3.模板DNA浓度过低。

  问题四:PCR产物出现片状拖尾

  1.DNA聚合酶过多或酶活性差。

  2.dNTP和Mg离子浓度过高。3.退火温度过低,PCR循环数偏多。4.模板DNA用量过大或模板DNA不纯。5.引物特异性差、引物间形成二聚体导致非特异性扩增。

  知道了问题的出现原因,就能有效的针对并改变PCR条件,跑出漂亮的条带了。最后祝大家,PCR每次都能成功扩出目的条带。

图例

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