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实时荧光定量PCR是检测实验步骤

发布时间:2022-07-15 10:42:42 阅读:11712次 来源:菲优特

  实时荧光定量PCR是检测生物样品中DNA、RNA含量的最普遍的方法,通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。

  荧光定量PCR原理

  通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,通过标准曲线对未知模板进行定量分析。Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

  实时荧光定量PCR服务内容

  1.从动物细胞、人或动物组织等样品中提取核酸;

  2.对核酸进行浓度及纯度分析;

  3.荧光定量PCR检测;

  (1)引物和探针的设计与合成;

  (2)绝对定量和相对定量的选择;

  (3)探针法和染料法的选择;

  (4)荧光定量PCR仪对目的基因的检测;

  (5)数据统计和分析;

  4.预实验服务:根据客户提供的目的基因序列或NCBI序列号提供客户引物和探针,并筛选出优化的引物和探针;

  5.正式实验服务:根据预实验筛选的引物和探针对所用样品进行荧光定量PCR的检测,并对结果进行统计和分析。

  荧光定量PCR检测方法

  1.SYBRGreenⅠ法:

  在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

  2.TaqMan探针法:

  探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

  荧光定量PCR应用

  实时荧光定量PCR是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量分析技术。随着分子生物学技术的不断发展,实时荧光定量PCR技术以其便携、快速高效、准确灵敏等优势,越来越受到人们的重视,在环境监测、医学等领域,生物及食品领域等方面具有重要的应用价值。

  定性分析

  1.病毒及病原菌检测

  2.物种鉴定

  3.基因分型

  定量分析

  绝对定量的应用

  1.病毒及病原菌定量分析

  2.导入基因拷贝数解析

  3.GMO定量解析

  相对定量的应用

  1.差异显示结果验证

  2.基因芯片结果验证

  3.siRNA效果确认

  4.mRNA表达量分析

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1374.html

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