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BrdU检测细胞增殖的方法步骤

2022-07-15 10:35:19
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  似于基于3H-胸腺嘧啶核苷掺入的增殖测量,可以通过使用5-溴2'-脱氧尿苷(BrdU)(胸苷的合成核苷类似物)通过FCM监测细胞分裂。为此,将BrdU掺入新合成的复制细胞DNA中(在细胞周期的S期),并使用对BrdU特异的荧光素单抗检测掺入比例。Ab与BrdU的结合通常需要通过使细胞暴露于酸或热来使DNA变性。BrdU的测量通常与活性染料和/或DNA染色一起用于细胞周期分析。

  尽管看似是一种简单的测定方法,但对于基于BrdU的细胞分裂检测,样品制备和DNA变性必须谨慎进行,因为处理太少会导致信号低,处理过多会影响DNA和所产生的信号 。样品需要洗净(至少三遍),因为任何残留的酸都会使检测到的抗体变性。此外,BrdU即使在4°C时也不稳定,因此必须新鲜使用。产生典型染色结果图如下(人PBMC用表面标记结合BrdU评估不同亚群增殖情况):

图例

  步骤

  用BrdU(~10μM)孵育细胞30–60分钟

  在4°C、冰冷70%v/v乙醇中悬浮至少30分钟,固定和沉淀细胞(这样处理之后,最多可保存7天)。

  离心去上清,用PBS洗涤一次后,在室温下与新鲜配制的2M HCl孵育30分钟(偶尔混合一下)。

  用PBS洗涤细胞两次,然后用PBS-吐温(PBS,含0.1%w/v BSA和0.2%v/v Tween 20,pH 7.4)重悬。

  将通过滴定实验确定的适量抗BrdU单抗添加至细胞悬液中,并在室温下避光孵育20分钟。(一定要注意避光,BrdU是光不稳定的)。

  用PBS-吐温洗涤样品两次。如果第5步用的抗BrdU单抗是未结合荧光素的,则洗涤后还需要加入二抗,在室温下孵育20-30分钟。

  用PBS洗涤后,将细胞沉淀与RNAse(50μL,100mg/ml)在室温或37°C下孵育15分钟。

  通过FCM分析,每个样本至少收集10000个事件。

  BrdU的替代品是修饰的核苷——EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷),与BrdU分析不同,EdU分析不是基于Ab的,因此不需要DNA变性,仅用温和的固定和去污剂的透化作用就即可结合DNA,并且其上面结合的荧光素能够发出足够高亮度的荧光。

  大家可根据自己的科研条件,选择不同的方法。

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