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细胞增殖实验BrdU法原理

2022-07-15 10:31:55
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  直接测定DNA合成是细胞增殖检测的最准确方法之一,是测定物质毒性、评估药物安全评价、细胞健康的基本方法,其中常用的方法有BrdU标记法。

   细胞增殖实验BrdU法原理:

  操作步骤:

  (1)细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35 mm培养皿中(内放置一盖玻片),培养1 d,用含0.4%FBS培养液同步化3 d,使绝大多数细胞处于G0期。

  (2)加入BrdU(储液:1.0 mg/ml,终浓度为0.03 μg/ml),37℃,孵育40min。

  (3)弃培养液,玻片用PBS洗涤3次。

  (4)甲醇/醋酸固定10 min。

  (5)经固定的玻片空气干燥,0.3%H2O2-甲醇30 min灭活内源性氧化酶。

  (6)5%正常兔血清封闭。

  (7)甲酰胺100℃,5 min变性核酸。

  (8)冰浴冷却后PBS洗涤,加1抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1:50),阴性对照加PBS或血清。

  (9)按ABC法进行检测,苏木素或伊红衬染,在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数,计算标记指数(LI)。

  注意事项:

  1.BrdU配制方法:10 mg溶于10 ml双蒸水,4℃下避光保存

  2.BrdU会肌体造成不可逆损伤,使用时注意安全,避免吸入BrdU粉尘。


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