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比色法细胞毒性测试方法, LDH法与CCK-8法比较

发布时间:2022-06-10 10:30:54 阅读:12552次 来源:伊莱瑞特生物

  一. 细胞毒性测试主要检测什么?

  细胞毒性(cytotoxicity),是指由细胞或化学物质引起的、单纯的细胞杀伤事件。它不依赖于细胞凋亡或坏死的过程和机制,并能引起细胞代谢的变化。

  在许多生化研究领域,如药物筛选、生物材料开发、食品安全等,细胞毒性试验不仅是基本的检测方法之一,也是非常必要的指标。目前我们评价细胞毒性时,一般是检测相关指标的变化。

细胞毒性试验的常见指标[1]

▲ 细胞毒性试验的常见指标[1]

  二. 比色法细胞毒性测试方法

  研究人员常用的细胞毒性检测方法主要有:染料排斥法、比色法、荧光检测法、化学发光法等等。选择合适的测定方法,对于获得准确可靠的结果十分重要。

  例如,对于药物开发而言,可靠的细胞毒性测试数据,对于评估药物的有效性、伤害性、抵抗性,及其对细胞增殖、死亡等作用的影响等至关重要,甚至决定了药物开发的成败。

  与其他方法比较,比色法具有操作简便、检测速度快等特点,适用于样本数量较多时的检测。目前常用的比色法细胞毒性测试方法如下表:

比色法细胞毒性测试方法

  三. LDH法与CCK-8法比较

  从上表中可以看出,LDH法与CCK-8法都具有染料水溶性好、细胞毒性弱、操作简单、检测时间短等优点,适合快速、高通量检测,使用的染料也基本相似。那么,这两种方法有何区别?在应用时该如何选择呢?

CCK-8检测原理

▲ CCK-8检测原理

  LDH法,通过检测受损细胞膜释放的LDH量,来确定死亡细胞数。乳酸脱氢酶(LDH),是一种稳定存在于细胞胞浆中的酶,在正常状态下,仅存在于细胞内。当细胞受到刺激死亡时,质膜发生破裂,LDH被迅速释放至细胞外(在实验中被释放到细胞培养液中),因此被作为细胞毒性研究中,使用最广泛的标记物之一。

  CCK-8法,通过检测活细胞中脱氢酶的活性,来确定活细胞数。脱氢酶(Dehydrogenase),是一类催化物质氧化还原反应的酶。物质经脱氢酶催化氧化,最终经过电子传递链,发生氧化磷酸化,释放出ATP,是活细胞供能以维持生存的主要途径。

  二者相比较,LDH法在检测时直接反映了细胞的死亡率,即测定的吸光度越高,表明检测物质的细胞毒性越强。同时,LDH法也可用于细胞膜损伤实验。因其方法本身对细胞伤害较小,且不存在放射性同位素(如铬51)污染,适合在实验室进行操作。但其操作方法较CCK-8法相比略复杂,需要依据“0%细胞毒性”和“100%细胞毒性”两个对照点进行实验,其中,“100%细胞毒性”对照,对细胞完全裂解的程度要求较高。

  CCK-8法在检测时反映了活细胞的数量,间接地显示出了细胞毒性,即测定的吸光度与细胞毒性呈反比。同时,CCK-8法也适用于细胞增殖实验。该方法稳定性和灵敏度都较高,对贴壁和悬浮生长的细胞同样适用[2]。

  与LDH法相比,其操作方法和试剂组成更简单,在实验设计时,只需要一个对照点。但是,在使用CCK-8法测定细胞毒性时,由于其检测原理设定,有时很难判断,降低的吸光度究竟是由于活细胞数量的减少,还是细胞脱氢酶本身的活性降低。也即,影响脱氢酶活性的条件或物质,可能导致实际活细胞数与测定活细胞数间的差异。

  在实际研究中,两种检测方法可以相互验证,更加全面地评价物质的细胞毒性。两种细胞毒性评价指标,可以使用同一批细胞同时进行验证。

  参考文献

  1. Istifli, Erman Salih, and Hasan Basri İla, eds. Cytotoxicity: Definition, Identification, and Cytotoxic Compounds. BoD–Books on Demand, 2019.

  2. L Li, Y H Yang, S Wang, et al. Comparison of Cellular Activity Detection Methods. Journal of Biology, 2011, 2.

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1247.html

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