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荧光定量PCR的原理

发布时间:2022-07-16 10:23:05 阅读:1592次 来源:百度学术

  荧光定量PCR又称qPCR,是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

  荧光定量PCR的原理

  它检测的原理是这样的原理,包括探针类和非探针类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加;非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。探针法由于增加了探针的识别步骤,特异性更高,而非探针类则简便易行。例如:

  1.SYBRGreenⅠ法:SYBRGreenⅠ是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。特点:非特异性,需检测熔解曲线;单通道检测;使用方便,经济便宜;常用于实验室研究。

  2.TaqMan探针法:TaqMan探针是一种寡核苷酸探针,它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。特点: 特异性好;可以多通道检测;单独设计探针;价格较高;常用于临床检测。随着荧光检测PCR仪的商品化,实时荧光定量PCR进入了一个特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应和由计算机软件进行快速统计的全新时代,实现了PCR从定性或半定量到准确定量的飞跃。它的特点和优势是这样的

  1)特异性强:引物和探针的“双保险”,避免检测的假阳性。

  2)灵敏度高:分析PCR产物的对数期,自动化仪器收集荧光信号,避免了许多人为因素干扰。

  3)避免污染:全封闭反应,无须PCR后处理。

  4)实现定量:运用标准品获得标准曲线,结合Ct值进行准确定量。

  5)高效低耗:可实现一管多检。

  6)操作简便:在线式实时监测扩增结果,不必接触有害物质。

  7)快速:反应时间<1.5小时。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1375.html

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