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最常用的细胞凋亡检测方法是什么(annexinV/PI双染色法介绍)

发布时间:2022-09-09 10:20:24 阅读:11802次 来源:医学科研小坑

  细胞死亡的方式主要有两种,包括细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)。细胞坏死是早已被认识到的细胞死亡方式,而细胞凋亡是近年来逐渐被认识且越来越受到重视的细胞死亡方式。两种死亡方式最重要的区别是细胞坏死会释放出细胞内溶物,引起炎症反应,而细胞凋亡不会暴露细胞内溶物,一般被吞噬细胞吞噬清除,不引起炎症反应

  细胞凋亡,也称细胞程序性死亡,是指在一定的生理或者病理条件下,细胞主动的、高度有序的、自己结束其生命的过程。细胞凋亡是生物体中一种普遍存在的现象,胚胎形成、个体发育、衰老和损伤细胞的清除等都与细胞凋亡密切相关。细胞凋亡在免疫学中也非常重要,如T细胞在胸腺内发育的过程,经过阴性选择和阳性选择后,95%的胸腺细胞发生凋亡,只有5%的胸腺细胞发育为成熟T细胞进入外周。

  检测细胞凋亡的方法很多,如电子显微镜或者光学显微镜下的形态学观察、细胞DNA提取物的DNA梯状带电泳实验等。而流式细胞术是非常重要的检测细胞凋亡的方法,不仅可以定性,也可以定量。流式细胞术检测细胞凋亡的方法也有很多,其中最重要是annexinV/PI双染色法。其他的还有SYTO/PI双染色法、细胞DNA含量分析法、线粒体损伤检测法、活化的caspase-3检测法、FLICA标记法、甲酰胺诱导ssDNA单抗检测法、TUNEL法等。今天主要介绍一下annexinV/PI双染色法。

  Annexin V/PI双染色法

  正常细胞膜的磷脂分布是不对称的,活细胞中磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)位于细胞膜的内表面,细胞凋亡时,细胞膜发生变化,PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。annexinV是一种对PS有高度亲和力的、钙依赖性的磷脂结合蛋白,annexinV可以特异性地识别凋亡细胞表面的PS,而活细胞的PS位于细胞膜的内表面,无法与annexinV特异性结合。所以可以用FITC偶联的annexinV鉴别凋亡细胞和活细胞。

  坏死细胞的PS也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面,annexinV也能识别坏死细胞表面的PS,所以annexinV无法区分坏死细胞和凋亡细胞。而PI染料能够与细胞内的DNA结合区分坏死细胞和活细胞。凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整,PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合,所以PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞,而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合,坏死细胞内PI染料被488nm激光激发后会发射红荧光,被FL2或FL3通道接收。所以annexinV和PI同时使用,就可以区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞,这就是annexinV/PI双染色法检测细胞凋亡的原理。

  标记方法与常规标记荧光抗体的方能一样:加入适量的FITC­annexinV和PI,4℃静置30min即可。注意标记PI的方法与PI染色检测细胞内DNA含量的方法不同,不需提前固定细胞,因为本方法标记PI是为了检测细胞膜的通透性从而鉴别细胞是活细胞还是死细胞,而用PI检测DNA含量时必须先破坏活细胞的细胞膜的完整性使PI进入细胞内与DNA结合。

  下图是用annexinV/PI双染色法检测细胞凋亡得到的一张散点图。图中大致可以分为三大细胞群:右上象限的细胞表型为annexinV+PI+,代表的是坏死细胞;右下象限的细胞表型为annexinV+PI-,代表的是凋亡细胞;左下象限的细胞表型为annexinV-PI-,代表的是活细胞。通过annexin V/PI双染色法可以非常明确地区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞,并且可以定量分析各自所占的比例。

图例

  例:

  下图引自[1],作者用annexinV/PI双染色法检测人肺癌细胞系“H1299”和“A549”细胞凋亡,证明人肺癌细胞表面的TLR4受体与LPS结合后,能够增强其抵抗TNFα和TRAIL诱导的凋亡。

  从图中可以看出,TRAIL诱导后,H1299人肺癌细胞系的凋亡比例从3.36%上升到13.7%,被TNF-α/CHX诱导后,凋亡比例上升到16.9%;如果在诱导前加入LPS,活化H1299表面TLR4信号,被TRAIL诱导后凋亡比例只有3.8%,被TNF-α/CHX诱导后凋亡比例只有3.93%,说明H1299表面TLR4信号的活化能够促进其抵抗凋亡。另一个人肺癌细胞系A549的结果也相似,LPS活化TLR4信号后,TRAIL诱导凋亡比例从16%下降到3.09%,而TNF-α/CHX诱导凋亡比例从17%下降到11.8%。

图例

  [1]Weigang He, Qiuyan Liu, Li Wang, et al. 2007. TLR4 signaling promotes immune escape ofhuman lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.Molecular Immunology, 44:2850-2859.

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1569.html

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