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点亮 RNA 适体:照亮 RNA 世界

发布时间:2022-04-23 10:35:52 阅读:16972次 来源:本站

  2008 年,Osamu Shimomura、Martin Chalfie和 Roger Y. Tsien 因“发现和开发绿色荧光蛋白 GFP”而获得诺贝尔化学奖。没有人感到惊讶,因为使用荧光蛋白彻底改变了蛋白质研究。荧光蛋白实现了从分子生物学时代(重组 DNA)到细胞生物学时代的转变:研究体内生物分子。但是你有没有想过如何可视化那个出了名的困难分子 RNA?在本文中,我们将向您展示如何使用发光 RNA 适体。

  可视化 RNA 的问题

  使用相同的方法来融合 RNA 的报告分子和靶分子是很棘手的,因为它们比蛋白质更不稳定。

  当然,有一些方法可以了解 RNA 动力学。例如,可以使用 RT-PCR 研究样本中特定 RNA 分子的数量。通过将荧光寡核苷酸探针与目标 RNA 杂交,可以使用改良的 RNA荧光原位杂交(FISH)技术( ISH )在组织中观察到细胞 RNA。但 ISH 需要使用相关伪影进行组织固定。而且它不允许研究 RNA 代谢的动态过程,就像荧光蛋白可以对蛋白质做的那样。

  引入荧光 RNA 适体

  幸运的是,还有另一种研究 RNA 动力学的方法——荧光 RNA 适配体。适体是折叠成可以结合特定靶标的特定三级结构的寡核苷酸。

  在适体末端添加荧光标签,选择 mRNA 作为结合靶标,您就有了类似 FISH 的东西,但在活细胞中起作用。适体也可以作为代谢物的独立传感器或 RNA 分子的标签末端。

  什么是 LURA?

  Light-Up RNA 适体 (LURA) 是在结合非荧光小分子后发出荧光的内源性 RNA。与适配体的结合将分子在自由状态下消散的能量转化为荧光(图 1)。[1]

点亮 RNA 适体:照亮 RNA 世界

  图 1. LURA 如何与非荧光荧光素结合,从而产生荧光。图片来自 Ouellet [1],根据知识共享许可 CC BY 4.0 发布。

  LURA 的例子包括与 29 个核苷酸长的 RNA 蓝色荧光适体结合的 Hoechst 染料衍生物。[2]

  RNA适体是如何附着的?

  适配体几乎可以附着在任何 RNA 分子的末端,并且不会干扰它们的功能。适体在转录后立即开始发挥作用,这排除了蛋白质标签在发挥作用之前所经历的步骤,即翻译和折叠。

  使用 SELEX 选择新的 RNA 适体

  新的适体是从“通过指数富集系统进化配体”(SELEX)获得的。

  简而言之,SELEX 是一个广泛的寡核苷酸文库,由随机生成的序列组成,其两侧为恒定的 5' 和 3' 末端。这些末端作为引物起作用。文库序列与目标分子混合,不结合目标的分子通过亲和层析或顺磁珠上的目标捕获去除。

  最后,结合的寡核苷酸通过 PCR 被洗脱和扩增,用于随后的几轮选择。

  我可以用 Light-up RNA 适体研究什么?

  您可以使用 LURA 就从新陈代谢到翻译等主题提出许多研究问题。你只需要有创造力并阅读文献。例如:

  LURA 可以用作核糖开关。核糖开关是 RNA 的一部分,它们以稳定的结构折叠并在结合代谢物后改变荧光,例如重要的酶辅因子 S-腺苷-蛋氨酸 (SAM)。[3]

  LURA 可用于研究 RNA 合成和贩运。[4,5]

  LURA 可用于细胞内病毒 DNA 动力学。[6]

  目前可用的适配体

  最早开发的适体之一与绿色荧光团结合:3,5-二氟-4-羟基苯亚甲基咪唑啉酮 (DFHBI),并被想象成“菠菜”。(令人困惑的是,上面列出的应用程序与植物无关。[3,4])不幸的是,它在 37 时非常不稳定?并且需要 tRNA 支架才能在体内发挥作用。[1,7]

  将 SELEX 与 FACS 结合使用菠菜的衍生物 Spinach2 作为选择起点,可以选择对配体具有更好亲和力的新 LURA。名为 Broccoli 的 49 个核苷酸长的 RNA 寡核苷酸可激活 DFHBI 或 DFHBI-1T 的荧光。它还具有改善的细胞内稳定性。[8]

  以水果和蔬菜为主题,结合乙酰化三唑橙的 39 个核苷酸长的适体被命名为“芒果”。Mango 是具有荧光持续数小时而非数秒的下一代适体。它结合三唑橙乙酰化 (TO1) 的衍生物。如果在第二步被生物素化,则称为TO1-Biotin。[1]

  截至 2021 年,已有数十种荧光团颜色从黄色到蓝色的适配体可供使用,并且数量不断增加(表 1)。

表 1.最常用的发光适体

  表 1.最常用的发光适体(表改编自 Bouhedda等人[9];参见其中的更多示例和主要参考文献)。*亮度计算为 = (? × ? complex )/1000

  从表中可以看出,第一代“植物”适体不是很亮,通常低于中等水平表达的 GFP。但不要害怕,有一种新作物来克服这个问题。“胡椒”适体最初是为了结合不稳定的荧光肽而开发的。第二代 Peppers 结合了八种荧光染料,从青色到红色,还有一些可以共表达。[10]

  如何获得 Light-up RNA 适体?

  如果现有的适配体可以帮助您回答您的研究问题,那么您很幸运。如果您想将 LURA 应用到一个新的研究问题,这个任务最好被比作为您选择的蛋白质获得一抗。


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1077.html

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