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DNA 提取试剂盒在实验室中的工作原理

发布时间:2022-04-23 10:33:25 阅读:15842次 来源:本站

  不了解 DNA 提取试剂盒的工作原理?我们将介绍本文中的基础知识,以便您完善核酸分离并获得高质量的 DNA。

  我们在 Bitesize Bio 为RNA和DNA提取提供了很多故障排除帮助, 因为我们在分子生物学中所做的几乎所有事情在第一步都需要 DNA 或 RNA,无论是 qPCR、分子克隆、下一代测序还是其他。

  如今,大多数实验室都使用商业 DNA 提取试剂盒,这些试剂盒使用二氧化硅旋转过滤器方法来获得高质量的 DNA。这些允许快速有效地纯化 DNA(或 RNA)。但这确实意味着许多人只是按照说明进行操作,并不了解 DNA 提取试剂盒的工作原理。

  为什么您应该知道核酸提取试剂盒的工作原理?

  离心柱包含选择性结合 DNA 和 RNA 的硅胶树脂,具体取决于盐条件和其他受提取方法影响的因素。

  当一切顺利时,这些 DNA 提取试剂盒使整个过程比旧的 DNA 提取方法更容易和更快。

  但是,使用套件的缺点是,如果您不了解套件黑匣子中的内容,则会使故障排除变得更加困难。

  因此,在本文中,我将详细解释 DNA 提取试剂盒的工作原理以及每一步发生的情况。

  我还将讨论一些在 DNA 提取中使用硅胶柱所特有的常见问题,只需稍加了解即可克服或避免这些问题。

  RNA 和 DNA 提取的第一步:裂解

  裂解公式可能会根据您是要提取 DNA 还是 RNA 而有所不同,但共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。

  介绍离液剂

  离液剂破坏氢键、范德华力和疏水相互作用。蛋白质不稳定,包括核酸酶,核酸与水的结合被破坏,从而为转移到二氧化硅创造条件。

  离液盐包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。

  不要忘记清洁剂

  除了离液剂外,裂解缓冲液中通常还有一些去污剂来帮助蛋白质溶解和裂解。

  添加一些酶

  根据样品类型,也可能有用于裂解的酶。蛋白酶 K 就是其中之一,实际上在这些变性缓冲液中效果很好;蛋白质变性越多,蛋白酶 K 的作用就越好。

  然而,溶菌酶在变性中不起作用,因此通常在添加变性盐之前进行溶菌酶处理。

  关于质粒制备的注意事项

  关于分离质粒 DNA 的一条评论:裂解与提取 RNA 或基因组 DNA 提取非常不同,因为必须首先将质粒与基因组 DNA 分离。

  如果你加入离液剂,你会立即释放所有东西,并且无法将小环状 DNA 与高分子量染色体进行差异分离。

  因此,在质粒制备中,直到裂解后才添加离液剂,并且盐用于结合。

  这里有一篇关于碱裂解的优秀深入文章 ,还有另一篇关于基因组 DNA 和质粒 DNA 之间差异的文章可供进一步阅读。

  DNA 提取后进行纯化:将 DNA 与色谱柱结合

  离液盐对于裂解至关重要,而且对于将 DNA(或 RNA)与色谱柱结合也很重要。此外,为了增强和影响核酸与二氧化硅的结合,还添加了酒精。

  大多数时候这是乙醇,但有时可能是异丙醇。乙醇百分比和体积有很大的影响。太多,你会带来很多降解的核酸和小物种,这会影响 A260 读数并降低你的一些产量。太少,可能很难洗掉膜上的所有盐分。

  这里重要的一点是乙醇会影响结合,并且添加量针对您使用的任何试剂盒进行了优化。修改该步骤可以帮助改变您恢复的内容,因此如果您在 RNA 或 DNA 恢复方面遇到问题并想要对其进行故障排除,则可以进行进一步评估。

  诊断问题的另一种方法是保存结合后的流出物并沉淀它,看看您是否可以找到您正在寻找的核酸。

  如果您在裂解中使用了含有 SDS 的去污剂,请尝试使用NaCl 作为沉淀剂,以避免去污剂污染 DNA 或 RNA。

  洗涤 DNA(或 RNA)

  您的裂解物通过硅胶膜离心,现在您提取的 DNA 或 RNA 应该与色谱柱结合,杂质、细胞蛋白和多糖应该已经通过。

  但是,膜仍然被残留的细胞蛋白和盐弄脏。如果样品来自植物,膜上仍然会有多糖,可能还有一些色素,或者如果样品是血液,膜可能会染成棕色或黄色。

  洗涤步骤用于去除这些杂质。

  通常有两次洗涤,尽管这可能因样品类型而异。第一次洗涤通常含有少量的离液盐以去除蛋白质和有色污染物。这之后总是进行乙醇洗涤以除去盐。

  如果准备开始时没有大量蛋白质,例如质粒准备或 PCR 清理,则只需要乙醇清洗。

  去除离液盐对于获得高产量和高纯度 DNA 或 RNA 至关重要。有些试剂盒甚至会用乙醇清洗色谱柱两次。

  如果盐留在后面,核酸的洗脱会很差,A230 读数会很高,导致 260/230 比率较低。

  对于无乙醇 DNA 和 RNA,您需要干转

  乙醇洗涤后,大多数协议都有一个离心步骤来干燥柱子。这是为了去除乙醇,对于干净的洗脱液是必不可少的。

  当将 10 mM Tris 缓冲液或水施加到膜上进行洗脱时,核酸会水合并从膜上释放出来。如果柱子上仍有乙醇,则核酸不能完全再水合。

  跳过干燥步骤会导致乙醇污染和低产量。我没有在 Nanodrop 上看到乙醇吸光度,因此它不会出现在您的读数中。

  问题的主要指标是当您尝试将样品加载到琼脂糖凝胶上时,DNA 不会下沉。即使在负载染料存在的情况下。另一个指标是,如果您将样品放在 -20°C 中,它不会冻结。

  RNA 和 DNA 提取,最后的前沿:洗脱

  DNA 提取方案的最后一步是从硅胶中释放纯 DNA 或 RNA。

  对于 DNA 制备,通常使用 pH 值在 8-9 之间的 10 mM Tris。DNA 在弱碱性 pH 值下更稳定,在缓冲液中溶解得更快。即使对于 DNA 颗粒也是如此。水的 pH 值往往较低,低至 4-5,高分子量 DNA 可能不会在用于洗脱的短时间内完全再水化。

  通过在离心前让缓冲液在膜中停留几分钟,可以最大限度地洗脱 DNA。

  另一方面,RNA 在微酸性的 pH 值下很好,因此水是首选的稀释剂。RNA 易溶于水。

  RNA 和 DNA 提取还会出现哪些其他问题

  低产量

  如果您的 DNA/RNA 产量低于您对样品的预期,则需要考虑许多因素。通常,这是一个裂解问题。不完全裂解是低产量的主要原因。它也可能是由不正确的绑定条件引起的。确保使用新鲜的优质乙醇(100% 200 证明)来稀释缓冲液或添加到结合步骤中。劣质乙醇或旧库存可能已经吸收了水,并且浓度不正确。如果洗涤缓冲液制备不当,您可能正在洗掉提取的 DNA 或 RNA。

  低纯度

  如果提取的 DNA 被蛋白质污染(低 260/280),那么可能您开始时样品过多,而蛋白质没有完全去除或溶解。

  如果 DNA 的 260/230 比率较差,则问题通常是结合或洗涤缓冲液中的盐分。确保使用最高质量的乙醇制备洗涤缓冲液,如果问题仍然存在,请再次洗涤色谱柱。

  与其他样品相比,一些样品含有更多的抑制剂。环境样品特别容易出现纯度问题,因为腐殖质在萃取过程中会溶解。

  腐殖质的行为与 DNA 相似,很难从硅胶柱中去除。对于这种类型的样品, 存在专门的技术来在柱步骤之前去除蛋白质和腐殖质。

  降解

  这对于 RNA 制备来说更受关注,这里有一篇文章给出了关于 RNA 分离的具体建议。

  主要是在 RNA 提取中,由于样品储存不当或裂解效率低下而发生降解,当然前提是您用不含 RNase 的水洗脱。

  对于 DNA 提取,降解不是一个大问题,因为对于 PCR,DNA 可以被剪切并且工作正常。但是,如果您希望没有那么多剪切的 DNA,那么您可能使用了太强的裂解方法。

  PCR 净化特殊注意事项

  PCR 净化本身显然不是一种 DNA 提取技术,但它是一种很好且简单的技术,因为它只是添加高浓度的结合盐(通常在每体积 PCR 反应中加入 3-5 体积的盐)并通过离心列。

  因此,当 PCR Clean-up 试剂盒失效时,尤其令人沮丧。我问人们的第一个问题是“你检查过凝胶上的 PCR 结果吗?” 因为您无法通过紫外线检查 PCR 反应并获得准确的 DNA 定量。

  在 260 度吸收紫外线的 PCR 反应中有太多:核苷酸、去污剂、盐和引物。

  根据我的经验,PCR 清理试剂盒经常无法正常工作是由 PCR 反应失败导致的,因此没有什么需要清理的。但如果您知道您有一个强 PCR 产物,最好的方法是在结合后保存您的流通部分。

  如果 DNA 不结合,那就是它的位置。你总是可以拯救它,然后再次清理它。然后致电技术支持并要求更换套件。

  自信满满地进行 RNA 和 DNA 提取

  当然,作为科学家,我们想确切地知道我们的实验发生了什么,并且能够在不必先致电技术服务的情况下进行故障排除。

  我希望这篇文章有助于阐明一些关于用于 RNA 和 DNA 提取的二氧化硅自旋过滤法的科学知识,以便您做出自己的诊断和修复。

  因此,当您致电技术服务时,您将首先仔细检查一些最可能导致问题的原因,而不是经历大量繁琐的工作,您可以更快地找到解决方案。即使那是免费更换的 DNA 提取试剂盒!


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1078.html

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