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为什么复苏细胞要慢速冷冻快速复苏(原因解析)

2023-03-29 10:25:58
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  细胞冻存与细胞复苏,是细胞培养过程中的常见工作。

  细胞冻存,是指将细胞贮存在超低温环境中,使细胞暂时“冬眠”的技术,在需要的时候再进行复苏。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。细胞复苏,是把冻存在-80℃冰箱或液氮中的细胞快速解冻重新培养,细胞恢复生长的过程。那么为什么复苏细胞要慢速冷冻快速复苏呢?

  细胞慢冻快融原则

  除了冻存保护剂之外,冷冻和升温的速度也直接影响细胞的存活率。做过细胞冻存复苏的人都可能听说过“慢冻快融”的原则。这样可以最大限度的保存细胞活力。如今细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

  慢冻是为了减少细胞内的水分,从而降低水分结冰导致的伤害。为了说清这个道理,需要一点点物理学知识。我们知道,水溶液结冰是一个溶质溶剂相互作用的过程。溶液的浓度越高,开始结冰的温度(冰点)就越低。溶液结冰时,作为溶剂的水优先结冰,同时把溶质外排,这样就导致溶质的浓度越来越高。溶质的浓度越高,则剩下的溶液要进一步结冰,需要的温度就更低,直到一个最终完全结冰的温度(共熔点)。也就是说,水溶液的结冰是一个温度逐渐降低(从冰点最后降低到共熔点)、溶液浓度逐渐升高的过程。

  但是这样的结冰过程也是有条件的,那就是外界的温度不能急剧降低,让溶剂结冰的时候,有足够的时间把溶质排除到冰体之外。否则,温度降低太快,溶质就会被困在溶剂中间一同凝固,这在物理学上叫玻璃化凝固,而非真正的结冰。慢冻就是为了让冻存液真正结冰,结冰的过程中,冻存液的浓度会逐渐提高,渗透压也逐渐提高,细胞内的水分就会逐渐渗透到细胞外,从而减弱细胞内水分结冰导致的伤害。

  理论和实践表明,细胞冷冻的速度控制在每分钟降低1°C效果好。

  那么快融又是什么道理呢?

  快融是为了防止融解过程中的局部区域发生反复冻融。

  细胞冻存介绍

  冻存原则

  细胞冻存原则为“慢冻”,即让细胞在缓慢降温的条件下逐渐冷冻。

  如果直接将细胞悬液放在超低温下快速冷冻,细胞会受到冷冻损伤而死亡。在冻存液中添加的保护剂(如DMSO、甘油)和在冻存盒中添加的异丙醇,都起到程序性降温的作用。

  细胞冻存密度

  细胞冻存和复苏过程中,不可避免会损失部分细胞,所以冻存的密度不能太低。提高冻存密度有助于提升细胞复苏存活率,推荐密度为100~300万细胞/mL。

  细胞冻存步骤

  待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为例

  a. 收集细胞,装入无菌离心管中,1000 rpm条件下离心4 min,弃去上清液,用PBS清洗一遍,弃尽PBS,进行细胞计数。

  b. 根据细胞数量加入无血清细胞冻存液,使细胞密度5×106~1×107/mL,轻轻混匀,每支冻存管冻存1mL细胞悬液,注意冻存管做好标识。

  c. 将冻存管放入-80℃冰箱,24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

  细胞复苏介绍

  细胞复苏讲究“快融”,越快融化,细胞所受损伤就越小。细胞复苏的操作不复杂,但每一步都必须稳扎稳打,才能最大限度地提高复苏存活率。

  细胞复苏步骤

  1. 冻存细胞从液氮中取出后,立即放入37°C水浴中,轻轻摇动冷冻管,使其在1分钟内全部融化(不要超过3分钟),加4 mL培养基混合均匀。

  2. 在1000 rpm条件下离心5 min,弃去上清液,加1-2 mL培养基后吹匀

  3. 将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6 cm皿中,加入约4mL培养基,培养过夜)。

  4. 第二天换液并检查细胞密度。

  如何判断细胞复苏成功与否

  判断细胞复苏成功与否,需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率(细胞存活率将冻存管内剩余的细胞,用台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞,活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞,得出细胞存活率)。如果复苏后95%以上的细胞贴壁,而且细胞的活性好,这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长,达到正常的生长特性(比如细胞群体倍增时间等)后要再冻存以补充细胞储存数量。

  需要注意的是,复苏的细胞需要一段时间恢复状态,当复苏后的细胞密度低于80%时,48小时内不要换液,待细胞形态、生长速度等恢复正常,再进行细胞传代等操作,不要因为复苏后两三天细胞状态不好就丢弃,应耐心等待至少一周。


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