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分子实验-蛋白质分离纯化的方法及原理

发布时间:2021-12-02 10:42:31 阅读:114842次 来源:仪器网

  通常,对某一特定蛋白质的分离纯化的步骤包括前处理、粗分级、细分级三步,下面就让百越生物带你了解一下。

  前处理:

  对于某种蛋白质的分离纯化,首先需要通过溶解的状态从原来的组织或细胞中释放出蛋白质并且使原来的天然状态保持不变,从而使生物活性不丢失生。之后,按照不同的情况,选择适当的方法,破碎掉组织和细胞。可以使用电动捣碎机或匀浆机破碎或超声波对动物组织和细胞进行处理破碎。

  如果所要的蛋白主要在如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等某一细胞组分集中,那么可以通过差速离心的方法分开它们,对该细胞组分进行收集以作下步纯化的材料。如果所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的,那么必须使用超声波或去污剂解聚膜结构,然后使用适当介质来提取。

  粗分离

  当获得蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)以后,选择合适的方法来分离所要的蛋白与其他杂蛋白。通常使用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法来进行这一步的分离。这些方法不但操作简单,而且能够处理很多,既可以将大量的杂质除去,又可以使蛋白溶液浓缩。一些蛋白提取液体积比较打,使用沉淀或盐析法浓缩又不适用,那么进行浓缩的方法可以是超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法。

  细分离

  样品在进行粗分级分离以后,通常只有很小的体积,以及去除了绝大多数的杂蛋白大部分。通常使用包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等层析法来进行进一步纯化。作为Z后的纯化步骤选择包括区带电泳、等电点聚焦等电泳法也很有必要。蛋白质分离纯化的Z后步骤结晶,结晶过程不能够使蛋白一定是均一得到确保,然而只有在溶液中某种蛋白在数量上占有优势时才能有结晶形成。

  离子层析法

  当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,会在离子交换剂上吸附带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质,之后通过对pH进行改变等方法洗脱吸附的蛋白质。

  有机溶剂提取

  与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)可以显著降低一些蛋白质在水中的溶解度,并且在一定的离子强度、温度以及PH值下,导致蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不一样,所以蛋白质的分离纯化能够通过对有机溶剂的浓度的控制来实现。在室温下,有机溶剂不但能够导致蛋白质的沉淀,而且会变性。所以,一般需要首先冷却,有机溶剂,之后为了避免局部浓度过高,不断搅拌并且将有机溶剂加入。能够在很大程度上解决蛋白质的变性问题。

实验操作

  蛋白质纯化主要方法

  1.蛋白质的选择吸附分离(利用颗粒不同程度的颗粒吸附力来使分离的目的达到)。

  2.按照配体特性的分离-亲和层析(利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异结合这一生物性质)

  3.低温有机溶剂沉淀法,使用如甲醇,乙醇或丙酮等与水可混溶的有机溶剂,降低多数蛋白质的溶解度并且将其析出,和盐析相比较,这种方法的分辨率更加的高,然而蛋白质比较容易变形,需要在低温下进行。

  4.按照分子大小不一样的方法,密度梯度离心(在介质中对蛋白质离心时,蛋白质沉降速度取决于它的质量和密度,质量和密度越大,那么沉降越快;凝胶过滤(一种柱层析);超过滤(利用蛋白质分子不能从半透膜通过的性质)。

  5.按照溶解度差异分离,等电点沉淀法盐溶与盐析(使用一定浓度盐溶液来使蛋白质的溶解度增大或减小);(因为在等电点时蛋白质分子的净电荷为0,使分子间静电斥力减少了,所以,聚集沉淀比较容易,这时具有Z小的溶解度)。

  6.按照电荷不同的分离方法。主要分为离子交换层析和电泳分离。

  蛋白质纯化注意事项

  1.为了避免蛋白质变性,不要对样品剧烈搅动和反复冻融。

  2.缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。

  3.为了避免蛋白质的氧化,将0.1~1mmol/LDTT(二硫苏糖醇)(或β-巯基乙醇)加入到缓冲溶液中。

  4.为了避免重金属对目标蛋白的破坏,将1~10mmol/LEDTA金属螯合剂加入。

  5.为了避免微生物生长,使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候,均必须时刻对它的稳定性注意维护,使它的活性得到保护,需要牢记如下一些通用的注意事项。

  6.尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作

  7.蛋白浓度不要太稀。

  8.除非是进行聚焦层。否则pH需要合适,防止所使用的缓冲溶液pH与pI相同,使蛋白质的沉淀得以避免。

  9.使用蛋白酶YZ剂,避免蛋白酶对目标蛋白的降解;在纯化细胞中的蛋白质时,将DNA酶加入来使得DNA降解,避免DNA对蛋白的污染。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/523.html

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