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分子实验外包-蛋白纯化的方法步骤及注意事项

发布时间:2021-12-02 10:25:59 阅读:118162次 来源:百度学术

  蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛,是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质,一些含量十分丰富,一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质,必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。

  蛋白纯化主要方法

  1. 蛋白质的选择吸附分离(利用颗粒不同程度的颗粒吸附力来使分离的目的达到)。

  2. 按照配体特性的分离-亲和层析(利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异结合这一生物性质)

  3. 低温有机溶剂沉淀法,使用如甲醇,乙醇等与水可混溶的有机溶剂,降低多数蛋白质的溶解度并且将其析出,和盐析相比较,这种方法的分辨率更加的高,然而蛋白质比较容易变形,需要在低温下进行。

  4. 按照分子大小不一样的方法,密度梯度离心(在介质中对蛋白质离心时,蛋白质沉降速度取决于它的质量和密度,质量和密度越大,那么沉降越快;凝胶过滤(一种柱层析);超过滤(利用蛋白质分子不能从半透膜通过的性质)。

  5. 按照溶解度差异分离,等电点沉淀法盐溶与盐析(使用一定浓度盐溶液来使蛋白质的溶解度增大或减小);(因为在等电点时蛋白质分子的净电荷为0,使分子间静电斥力减少了,所以,聚集沉淀比较容易,这时具有最小的溶解度)。

  6. 按照电荷不同的分离方法。主要分为离子交换层析和电泳分离。

  蛋白纯化操作步骤:

  1. 所有在纯化系统里使用的溶液当日都需要经过0.22μm的滤膜抽滤、脱气处理;保存4℃冰箱里的缓冲液若要在室温使用需恢复至室温后抽滤脱气;

  2. 样品上柱纯化前,需先滤膜过滤,少量样品可用离心(13000rpm,10min);

  3. 依次用水、缓冲液洗泵;设置流速和柱前警报压(压力值参阅层析柱及填料说明书,取较小的一个最大耐受压力)。防止柱中进入气泡,影响分离效果;

  4. 当柱子限压在0.3MPa,或者在限压状态下流速很低时,pH valve 中的Restirtor 可以切换成Off line,即显示By-pass状态;

  5. 当需要通过仪器上样环上样时,将W1阀口处换成带透明短软管的阀门,从此处阀门位通过注射器倒吸样品上样;

  6. 进样阀“Inject”为上样状态。上样结束可将进样阀切换回“Load”状态。并用纯水认真清洗上样环至少3次;将W1阀口处换回原来接头阀门。

  7. 纯化结束后,用纯水清洗泵和平衡柱子;再用20%的乙醇清洗泵以及系统。长期不用,层析柱应保存在20%的乙醇中,泵放置在20% 乙醇中;

  8. 实验结束后及时倾倒废液瓶里的废液;

实验室器材

  蛋白纯化注意事项

  1.为了避免蛋白质变性,不要对样品剧烈搅动和反复冻融。

  2.缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。

  3.为了避免蛋白质的氧化,将0.1~1mmol/LDTT(二硫苏糖醇)(或β-巯基乙醇)加入到缓冲溶液中。

  4.为了避免重金属对目标蛋白的破坏,将1~10mmol/LEDTA金属螯合剂加入。

  5.为了避免微生物生长,使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候,均必须时刻对它的稳定性注意维护,使它的活性得到保护,需要牢记如下一些通用的注意事项。

  6.尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。

  7.蛋白浓度不要太稀。

  8.除非是进行聚焦层。否则pH需要合适,防止所使用的缓冲溶液pH与pI相同,使蛋白质的沉淀得以避免。

  9.使用蛋白酶抑制剂,避免蛋白酶对目标蛋白的降解;在纯化细胞中的蛋白质时,将DNA酶加入来使得DNA降解,避免DNA对蛋白的污染。

  蛋白纯化原则

  蛋白纯化对不同蛋白间内在的相似性与差异进行利用,对各种蛋白间的相似性进行利用来将非蛋白物质的污染去除并且而利用各蛋白质的差异从其他蛋白中纯化出目的蛋白。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性均会存在差异,利用这些差异能够从如大肠杆菌裂解物等混合物中将蛋白提取出来,从而使重组蛋白得到。

  粗分离和精细纯化阶段为蛋白的纯化主要的两个阶段。通常采用树脂法来进行蛋白的纯化。

  粗分离阶段主要分开目的蛋白和如DNA、RNA等其他细胞成分,因为,这个时候,样板具有比较大的体积,比较杂的成分,因而所用的树脂应当满足宽粒径分布,大颗粒,流速高,以及容量高的特点,并且能够迅速分开蛋白与污染物,如有必要,可以将如蛋白酶YZ剂的相应的保护剂加入,避免降解目的蛋白。

  精细纯化阶段则则需要达到更高的分辨率要求,这个阶段需要区分开目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白,为了使分辨率提高,需要使用更加小的树脂颗粒。离子交换柱和疏水柱经常被使用,树脂的选择性和柱效两个因素在应用的时候需要综合考虑。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/522.html

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