您的位置:首页>>公司动态>>企业动态

分子实验外包-包涵体蛋白变复性案例

发布时间:2021-12-04 10:14:38 阅读:14002次 来源:钟鼎生物

  使用IPTG诱导表达目的蛋白a。优化表达条件,将诱导条件调整至37℃,经分析目标蛋白主要呈包涵体形式。因此通过变复性的方式,重溶目标蛋白a,通过Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。

  蛋白表达鉴定结果分析

  IPTG诱导蛋白表达,经12% SDS-PAGE分析,目标蛋白主要存在于沉淀中,结果如图所示

蛋白表达鉴定SDS-PAGE分析

  图1 蛋白表达鉴定SDS-PAGE分析

  Fig.1 SDS-PAGE analysis of expression

  M: 蛋白质分子质量标准

  1: 未诱导

  2: 诱导后

  3: 诱导破碎后上清

  4: 诱导破碎后沉淀

  包涵体蛋白的变复性

  1. 将菌体沉淀重悬于20 ml 裂解液 (20 mM Tris-HCl containing 1 mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail, pH 8.0),超声破碎(功率400 W,工作4sec,间歇8sec,共20min);

  2. 将超声破碎的细胞裂解液4℃ 10000 g离心20 min,收集沉淀;

  3. 使用包涵体洗涤液(20mM Tris,1mM EDTA,2M尿素,1M NaCl,1%Triton X-100,pH8.0)洗涤包涵体3次;

  4. 用溶解缓冲液(20mM Tris,5mM DTT,8M尿素 pH8.0),按一定比例溶解包涵体,4℃放置过夜;室温,15000 rpm离心15min;

  5. 将上述溶液滴加20 mM Tris-HCl ,100 mM NaCl ,pH8.0缓冲液中,逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌,将蛋白溶液装入透析袋于20 mM Tris-HCl,100 mM NaCl,pH8.0溶液中透析过夜。

  包涵体融合蛋白的Ni柱亲和纯化及结果分析

  包涵体蛋白Ni柱纯化

  1. 利用低压层析系统,包涵体溶液以0.5 ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱;

  2. 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;

  3. 用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl,20 mM咪唑,0.15 M NaCl,pH8.0) 以1 ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;

  4. 用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl,250 mM咪唑,0.15 M NaCl,pH8.0) 以1 ml/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液;

  5.上述收集的蛋白溶液加入透析袋中,使用20 mM Tris-HCl,0.15 M NaCl,pH8.0进行透析过夜;

  6. 进行12% SDS-PAGE分析, 结果如Fig.2所示。

  纯化结果分析

  包涵体经过变复性的方式,重溶目标蛋白,通过Ni柱亲和纯化获得目标蛋白,进行12% SDS-PAGE分析。

12-1-1.png蛋白纯化SDS-PAGE分析

  图2 蛋白纯化SDS-PAGE分析

  Fig.2 SDS-PAGE analysis of fusion protein purification

  M: 蛋白质分子质量标准

  1: 破碎后处理样品

  2: 流出

  3: 洗脱

  Western Blot方法检测包涵体复性

  (1) 取样品上样5 μl

  (2)上样完毕后,聚丙烯酰胺凝胶先90 V跑完积层胶,再将电压升至200 V直到电泳结束。

  (3)电泳结束后,取下凝胶进行转膜,恒压100 V转膜,约为1.5h,恒流250 mA

  (4)电转结束后,取下膜后先用PBST洗涤4次,每次5min。

  (5)将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃ 1h。

  (6)用封闭液稀释一抗,膜在一抗稀释液中4℃过夜。

  (7)次日将膜取出后用PBST 洗膜4次,每次5 min,

  (8)用含5%牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1h。

  (9)反应完毕后,把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次,每次5 min。

  (10) ECL显影,曝光。

  Western Blot结果分析

  一抗以及二抗稀释比例:

抗以及二抗稀释

蛋白Western Blot鉴定分析

  图3 蛋白Western Blot鉴定分析

  Fig.3 Western Blot analysis of fusion protein purification

  M: 蛋白质分子质量标准

  1: 纯化后样品


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/524.html

注释:[本文仅供阅读]不代表企业及作者的立场,如侵权请联系删除,欢迎分享本文,转载请保留出处!

推荐服务

  • 分子实验

    分子实验平台为广大科研工作提供蛋白、RNA和DNA分子类分析及检测服务···

  • 细胞实验

    细胞实验平台为广大科研工作者提供原代细胞提取、鉴定和培养相关服务···

  • 病理实验

    动物实验平台为广大科研工作者提供动物寄养、疾病模型构建和体内验证···

  • 动物实验

    动物实验平台为广大科研工作者提供科研成果向产品转化的服务,转化方···

  • 精准医疗

    精准医疗平台为癌症患者提供肿瘤移植动物体内服务,模拟患者癌症发展···