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基因克隆-要求、原理、步骤、应用

发布时间:2022-02-01 10:16:26 阅读:17562次 来源:百度学术

  使用基因工程技术生产特定基因或DNA序列的精确副本称为基因克隆。

  术语“基因克隆”、“DNA 克隆”、“分子克隆”和“重组 DNA 技术”均指相同的技术。

  当从生物体中提取 DNA 时,将获得其所有基因。在基因(DNA)克隆中,特定基因被复制形成“克隆”。

  克隆是一种用于分离和扩增目的基因的方法。

  DNA克隆可以通过两种不同的方法实现:

  基于细胞的 DNA 克隆

  无细胞 DNA 克隆 (PCR)

  基因克隆的要求(基于细胞)

  包含要克隆的所需基因的DNA 片段。

  限制酶连接酶

  载体——在宿主细胞中携带、维持和复制克隆基因。

  宿主细胞——重组DNA可以在其中复制。

  基因克隆原理

  将含有待克隆基因的 DNA 片段插入合适的载体中,以产生重组 DNA 分子。该载体充当将基因转运到宿主细胞(通常是细菌)中的载体,尽管可以使用其他类型的活细胞。在宿主细胞内,载体增殖,不仅产生自身的大量相同拷贝,还产生其携带的基因的大量相同拷贝。当宿主细胞分裂时,重组 DNA 分子的拷贝被传递给后代,并发生进一步的载体复制。在大量细胞分裂后,产生相同宿主细胞的集落或克隆。克隆中的每个细胞都含有一个或多个拷贝的重组 DNA 分子;现在据说重组分子携带的基因被克隆了。

  基因克隆的步骤

  基因克隆涉及的基本 7 个步骤是:

  分离待克隆的 DNA [目的基因] 片段。

  将分离的 DNA 插入合适的载体以形成重组 DNA。

  将重组 DNA 引入称为宿主的合适生物体中。

  选择转化的宿主细胞并鉴定含有目的基因的克隆。

  引入基因在宿主中的增殖/表达。

  分离多个基因拷贝/基因表达的蛋白质。

  分离的基因拷贝/蛋白质的纯化

基因克隆的步骤

  A. DNA 片段或基因的分离

  必须首先分离要克隆的目标 DNA 或基因。感兴趣的基因是我们感兴趣的产物(蛋白质、酶或激素)的基因片段。例如,编码激素胰岛素的基因。

  可以使用限制性内切酶 (RE) 分离所需的基因,该酶在称为限制性位点的特定识别核苷酸序列处切割 DNA,朝向内部区域(因此是内切酶)产生平末端或粘性末端。

  有时,也可以使用逆转录酶,利用其mRNA合成所需基因的互补DNA链。

  B. 选择合适的克隆载体

  载体是一种载体分子,可以将感兴趣的基因 (GI) 携带到宿主中,并与 GI 一起复制到宿主中,从而产生多个拷贝。

  克隆载体受限于它们可以携带的插入片段的大小。根据插入物的大小和应用选择合适的载体。

  可用于克隆的不同类型的载体是质粒、噬菌体、细菌人工染色体 (BAC)、酵母人工染色体 (YAC)哺乳动物人工染色体 (MAC)。

  然而,除了所有其他可用载体外,最常用的克隆载体还包括质粒和噬菌体(λ噬菌体)。

  C. 克隆载体的基本特征

  所有的克隆载体都是载体 DNA 分子。这些载体分子一般应具有很少的共同特征,例如:

  它必须在宿主细胞内自我复制。

  它必须具有唯一的 RE 酶限制位点。

  供体 DNA 片段的引入不得干扰载体的复制特性。

  它必须具有一些标记基因,以便它可以用于以后鉴定重组细胞(通常是宿主细胞中不存在的抗生素抗性基因)。

  它们应该很容易从宿主细胞中分离出来。

  D. 重组 DNA 的形成

  质粒载体被用于分离供体 DNA 片段的相同 RE 酶切开。

  供体DNA片段和质粒载体的混合物混合在一起。

  在存在 DNA 连接酶的情况下,供体 DNA 片段和质粒载体发生碱基配对。

  由此产生的 DNA 分子是两个 DNA 分子的混合体——GI 和载体。在遗传学术语中,这种不同 DNA 链的混合称为重组。

  因此,这种新的杂合DNA分子也被称为重组DNA分子,该技术被称为重组DNA技术

  E. 将重组载体转化为合适的宿主

  重组载体主要转化到合适的宿主细胞,细菌细胞。

  这样做是出于以下一个或两个原因:

  复制重组 DNA 分子以获得 GI 的多个拷贝。

  允许 GI 的表达,使其产生所需的蛋白质产物。

  有些细菌是天然可转化的;它们自动吸收重组载体。

  例如: 芽孢杆菌属、嗜血杆菌属、幽门螺旋杆菌属,这些都是天生的。

  另一方面,其他一些细菌需要通过人工方法掺入,例如 Ca ++离子处理、电穿孔等。

  F. 重组细胞的分离

  转化过程产生了转化和非转化宿主细胞的混合群体。

  选择过程仅涉及过滤转化的宿主细胞。

  为了从非重组细胞中分离重组细胞,使用质粒载体的标记基因。

  例如,PBR322质粒载体含有不同的标记基因(氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。使用pst1 RE时,它从质粒中敲除氨苄青霉素抗性基因,使重组细胞对氨苄青霉素敏感。

  G. 选定宿主细胞的增殖

  一旦转化的宿主细胞通过筛选过程分离;有必要为它们提供最佳的生长和繁殖参数。

  在该步骤中,将转化的宿主细胞引入新鲜培养基中。

  在这个阶段,宿主细胞随着它们携带的重组DNA的复制而分裂和再分裂。

  如果目标是获得大量 GI 副本,则允许简单地复制宿主细胞。但是为了获得感兴趣的产品,必须提供有利的条件,以便向量中的 GI 表达感兴趣的产品。

  H. 产品的分离和纯化

  下一步涉及分离与载体相连的倍增的 GI 或由它编码的蛋白质。

  随后纯化分离的基因拷贝/蛋白质。

基因克隆-要求、原理、步骤、应用

  基因克隆的应用

  可以分离特定基因并确定其核苷酸序列

  可以识别和分析 DNA 的控制序列

  可以研究蛋白质/酶/RNA功能

  可以识别突变,例如与特定疾病相关的基因缺陷 可以为特定目的“改造”生物体,例如产生胰岛素、抗虫等。


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/777.html

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