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下一代测序 (NGS)(第三代测序技术的特征)

2022-01-31 10:50:58
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  下一代测序 (NGS) 是一个强大的平台,可以同时对数千到数百万个DNA分子进行测序。

  下一代测序 (NGS),也称为高通量测序,是一个包罗万象的术语,用于描述许多不同的现代测序技术。

  对低成本测序的高需求推动了高通量测序的发展,可同时产生数千或数百万个序列。

  它们旨在降低 DNA 测序的成本,超出标准染料终止方法的可能。

  因此,这些最近的技术使我们能够比以前使用的 Sanger 测序更快、更便宜地对 DNA 和 RNA 进行测序,从而彻底改变了基因组学和分子生物学的研究。

  NGS 分为不同代,克服了传统 DNA 测序方法的局限性,并已在广泛的分子生物学应用中得到应用。

  它被分类的世代包括:

  第一代

  桑格测序

  第二代测序

  焦磷酸测序

  可逆终止化学测序

  连接测序

  第三代测序

  单分子荧光测序

  单分子实时测序

  半导体测序

  纳米孔测序

  第四代测序

  旨在直接在细胞中进行基因组分析。

下一代测序 (NGS)

  重要的下一代测序技术

  Lynx 疗法的大规模并行特征测序 (MPSS)

Lynx 疗法的大规模并行特征测序

  它被认为是“下一代”测序技术中的第一个。

  MPSS 于 1990 年代由 Lynx Therapeutics 开发,该公司由 Sydney Brenner 和 Sam Eletr 于 1992 年创立。

  MPSS 是一种超高通量测序技术。

  当应用于表达谱时,它几乎可以显示样本中的每个转录本并提供其准确的表达水平。

  MPSS 是一种基于珠子的方法,它使用了一种复杂的接头连接方法,然后是接头解码,以四个核苷酸的增量读取序列;这种方法使其容易受到序列特异性偏差或特定序列丢失的影响。

  然而,MPSS 输出的基本属性是后来的“下一代”数据类型的典型特征,包括数十万个短 DNA 序列。

  在 MPSS 的情况下,这些通常用于对 cDNA 进行测序以测量基因表达水平。

  群落测序

群落测序

  它是一种廉价但高度准确的多重测序技术,可用于并行读取数百万个固定化 DNA 序列。

  这项技术首先由哈佛医学院的 George Church 博士开发。

  它将体外配对标签文库与乳液 PCR、自动显微镜和基于连接的测序化学相结合,以 > 99.9999% 的准确度和 Sanger 测序的成本约 1/10 对大肠杆菌基因组进行测序。

  高温测序

高温测序

  454 Life Sciences 开发了一种并行版本的焦磷酸测序,后来被罗氏诊断公司收购。

  该方法在油溶液中扩增水滴内的 DNA(乳液 PCR),每个液滴都包含一个 DNA 模板,该模板附着在一个涂有引物的珠子上,然后形成一个克隆菌落。

  测序仪包含许多皮升体积的孔,每个孔都包含一个珠子和测序酶。

  焦磷酸测序使用荧光素酶产生光以检测添加到新生 DNA 中的单个核苷酸,并且组合数据用于生成序列读数。

  与一端的 Sanger 测序和另一端的 Solexa 和 SOLiD 相比,该技术提供了中等的读取长度和每个碱基的价格。

  Illumina (Solexa) 测序

Illumina (Solexa) 测序

  Solexa 开发了一种基于染料终止剂的测序技术。

  在这种方法中,DNA 分子首先附着在载玻片上的引物上并进行扩增。这称为桥式放大。

  与焦磷酸测序不同,DNA 一次只能延伸一个核苷酸。

  相机拍摄荧光标记的核苷酸的图像,然后将染料与末端 3' 阻断剂一起从 DNA 中化学去除,从而开始下一个循环。

  固体测序

固体测序

  ABISolid 测序中使用的测序技术是寡核苷酸连接和检测。

  在此,所有可能的固定长度的寡核苷酸池根据测序位置进行标记。

  这种测序产生的序列数量和长度与光照测序相当。

  DNA纳米球测序

DNA纳米球测序

  它是一种高通量测序技术,用于确定生物体的整个基因组序列。

  该方法使用滚环复制来扩增基因组 DNA 分子的片段。

  与其他下一代测序平台相比,这种 DNA 测序允许每次运行对大量 DNA 纳米球进行测序,并且试剂成本低。

  然而,从每个 DNA 纳米球中只能确定 DNA 的短序列,这使得将短读数映射到参考基因组变得困难。

  该技术已用于多个基因组测序项目,并计划用于更多。

  Helioscope 单分子测序

  Helioscope 测序使用带有附加 polyA 尾接头的 DNA 片段,这些接头连接到流通池表面。

  接下来的步骤涉及基于延伸的测序,使用荧光标记的核苷酸循环洗涤流动池。

  读取由 Helioscope 定序器执行。

  读数很短,每次运行最多 55 个碱基,但最近对该方法的改进允许更准确地读取均聚物和 RNA 测序。

  单分子SMRT测序

单分子SMRT测序

  SMRT 测序是基于边合成边测序的方法。

  DNA 在所谓的零模式波导 (ZMW) 中合成 - 小井状容器,捕获工具位于井底。

  使用未修饰的聚合酶和在溶液中自由流动的荧光标记核苷酸进行测序。

  孔的构造方式是仅检测孔底部发生的荧光。

  荧光标记在核苷酸掺入 DNA 链时与核苷酸分离,留下未修饰的 DNA 链。

  SMTR 技术允许检测核苷酸修饰。这通过观察聚合酶动力学而发生。

  这种方法允许读取 1000 个核苷酸。

  单分子实时 (RNAP) 测序

单分子实时 (RNAP) 测序

  该方法基于连接在聚苯乙烯珠上的 RNA 聚合酶 (RNAP),测序 DNA 的远端连接到另一个珠子上,两个珠子都放置在光阱中。

  转录期间的 RNAP 运动使珠子更近,它们的相对距离发生变化,然后可以以单核苷酸分辨率记录。

  该序列是基于四种核苷酸类型中每一种的浓度降低的四个读数推断出来的。


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