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DNA微阵列技术原理(基于 cDNA 的微阵列涉及的步骤)

2022-02-01 10:31:02
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  DNA微阵列是固体支持物,通常由玻璃或硅制成,DNA 以有组织的预定网格方式附着在其上。

  每个 DNA 点(称为探针)代表一个基因。

  DNA微阵列可以同时分析数万个基因的表达。

  DNA微阵列有几个同义词,例如DNA芯片、基因芯片、DNA阵列、基因阵列和生物芯片。

DNA微阵列

  DNA微阵列技术原理

  DNA微阵列的原理在于核酸链之间的杂交。

  互补核酸序列的特性是通过在互补核苷酸碱基对之间形成氢键而相互特异性配对。

  为此,使用荧光染料标记样品。

  至少两个样品与芯片杂交。

  样品和连接在芯片上的探针之间的互补核酸序列通过氢键配对。

  非特异性键合序列在该过程的洗涤步骤期间保持未连接并被洗掉。

  与探针序列结合的荧光标记的靶序列产生信号。

  信号取决于杂交条件(例如:温度)、杂交后的洗涤等,而信号的总强度取决于存在的目标样品的量。

  使用该技术,可以在单次杂交中筛选出 1,00,000 个或更多序列中存在的一个基因组或 cDNA 序列。

  DNA微阵列的类型

  有 2 种类型的 DNA 芯片/微阵列:

  基于 cDNA 的微阵列

  基于寡核苷酸的微阵列

  斑点 DNA 阵列(“cDNA 阵列”)

  使用 cDNA 制备芯片。

  称为 cDNA 芯片或 cDNA 微阵列或探针 DNA。

  使用 PCR 扩增 cDNA。

  然后将它们固定在由载玻片的尼龙过滤器(1 x 3 英寸)组成的固体支持物上。通过毛细作用将探针 DNA 加载到点样旋转中。

  少量的这种 DNA 制剂被点在固体表面上,使这两者之间发生物理接触。

  DNA 以机械方式或机器人方式递送。

  寡核苷酸阵列(基因芯片)

  在寡核苷酸微阵列中,短 DNA 寡核苷酸被点到阵列上。

  少量 20-25mers/基因。

  寡核苷酸微阵列的主要特点是每个基因通常由一个以上的探针代表。

  通过计算机行业的光刻技术实现

  现成的

  DNA微阵列技术的要求

  设计 DNA 微阵列系统有一定的要求,即:

  DNA芯片

  目标样品(荧光标记)

  荧光染料

  探头

  扫描器

  基于 cDNA 的微阵列涉及的步骤

基于 cDNA 的微阵列涉及的步骤

  DNA微阵列的反应过程分为几个步骤:

  样品收集

  样本可能是我们希望对其进行研究的生物体的细胞/组织。

  收集两种类型的样本:健康细胞和感染细胞,用于比较并获得结果。

  mRNA的分离

  使用色谱柱或溶剂(如苯酚-氯仿)从样品中提取 RNA。

  从提取的 RNA 中分离出 mRNA,留下 rRNA 和 tRNA。

  由于 mRNA 具有 poly-A 尾,因此使用带有 poly-T 尾的柱珠来结合 mRNA。

  提取后,用缓冲液冲洗柱子以从珠子中分离出 mRNA。

  创建标记的 cDNA

  为了创建 cDNA(互补 DNA 链),需要对 mRNA 进行逆转录。

  然后将两个样品与不同的荧光染料结合以产生荧光 cDNA 链。这有助于区分 cDNA 的样本类别。

  杂交

  来自两个样品的标记 cDNA 被放置在 DNA 微阵列中,以便每个 cDNA 与其互补链杂交;它们也被彻底清洗以去除无界序列。

  收集和分析

  数据的收集是通过使用微阵列扫描仪完成的。

  该扫描仪由激光、计算机和照相机组成。激光激发 cDNA 的荧光,产生信号。

  当激光扫描阵列时,相机会记录产生的图像。

  然后计算机存储数据并立即提供结果。然后分析由此产生的数据。

  每个点颜色强度的差异决定了该特定点的基因特征。

  DNA微阵列的应用

  在人类中,它们可用于确定特定疾病如何影响各种组织中的基因表达模式(表达谱),或感染生物体的身份(来自表达谱)。因此,仅在临床医学中,DNA微阵列就具有巨大的诊断潜力。

  此外,它在许多领域都有应用,例如:

  药物的发现

  诊断和基因工程

  选择性剪接检测

  蛋白质组学

  功能基因组学

  DNA测序

  基因表达谱

  毒理学研究(毒物基因组学)

  DNA微阵列的优势

  实时提供数千个基因的数据。

  一次实验很容易产生许多结果。

  快速且容易获得结果。

  有望发现疾病和癌症的治疗方法。

  DNA的不同部分可用于研究基因表达。

  DNA微阵列的缺点

  制作成本高。

  一次产生太多结果需要很长时间进行分析,这在本质上是相当复杂的。

  DNA芯片的保质期不长。

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