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分子实验-PCR引物Tm值计算方法是怎么样的?

发布时间:2021-12-09 10:20:06 阅读:148132次 来源:百度学术

  在做PCR反应实验的时候,你是否遇到一些难以解决的问题?不知道Tm值的计算方法是怎么样的?不清楚PCR用引物的使用量?不了解简并性引物对PCR扩增有无影响?

  PCR (Polymerase Chain Reaction) 法是一种体外扩增DNA的方法。通过以下三个步骤:

  DNA链的热变性 (Denaturation step)

  引物退火 (Annealing step)

  聚合酶作用下引物的延伸 (Extension step)

  循环往复,可在短时间内扩增DNA达105倍以上。TaKaRa Taq 是一种94 kDa的高纯度耐热性DNA聚合酶,是把Thermus aquaticus YT-1株的DNA polymerase基因在大肠杆菌中表达后,分离提取得到的,与野生型DNA polymerase具有相同的功能。

  Step 1:在含有引物、dNTP及DNA聚合酶的反应液中双链DNA热变性 (94℃、30 sec)

  Step 2:引物与热变性生成的单链DNA退火 (55℃、30 sec)

  Step 3:在DNA聚合酶作用下合成互补链 (72℃、1 min)

  Step 4:扩增的双链DNA再次热变性生成单链DNA (返回Step 1)

  Step1~4称为一个循环,如此循环往复25~30次。

  注:不同的DNA片段要达到最高的扩增效率,需要设定不同的反应条件。

  设计PCR用引物时的注意事项,可以从以下几个方面考虑。

  1. 引物长度通常为20~25 mer。但进行LA PCR时,引物长度应增长为30~35 mer。

  2. 二条引物之间不能进行Annealing,对3′端的3个碱基需特别注意。

  3. GC含量在50~60%,避开局部富含GC或AT,为了使引物和模板稳定结合,3′端应避开AT rich结构。

  4. 避开引物自身形成二级结构。

  5. 选择Tm温度相互接近的二条引物。

实验室器材

  PCR引物Tm值计算方法是怎么样的?

  1、PCR用引物的Tm值的计算方法?

  引物为20 mer以下时:

  Tm = 2℃×(A+T) + 4℃×(G+C)

  引物为20 mer以上时:

  Tm = 81.5 + 0.41×(GC%) - 600/L

  其中L为引物的长度。

  在PCR反应过程中选择Annealing温度时,一般为 (Tm - 5)℃。

  2、设计PCR用引物时的注意事项?

  可以从以下几个方面考虑。

  1. 引物长度通常为20~25 mer。但进行LA PCR时,引物长度应增长为30~35 mer。

  2. 二条引物之间不能进行Annealing,对3′端的3个碱基需特别注意。

  3. GC含量在50~60%,避开局部富含GC或AT,为了使引物和模板稳定结合,3′端应避开AT rich结构。

  4. 避开引物自身形成二级结构。

  5. 选择Tm温度相互接近的二条引物。

  3、PCR用引物中含有Inosine (次黄苷) 碱基,其Tm值怎样计算?

  可以不考虑Inosine碱基,使用A、G、C、T计算Tm值就可以。

  4、PCR用引物的使用量?

  合适的终浓度可在0.1 μM~1.0 μM之间选择。引物的浓度太低时,有时扩增产物太少;引物浓度太高时,比较容易出现非特异性扩增反应。通常模板DNA的量较多或High complexity DNA (例如Human genome DNA) 作模板时,引物浓度应低一些;当模板DNA的量较少或Low complexity DNA (例如Plasmid等) 作模板时,引物浓度应高一些。

  5、简并性引物对PCR扩增有无影响?

  有影响。简并数量应尽量少。

  通常一条引物中简并的碱基不要超过4处,如果简并的碱基数过多,则会造成反应体系中有效引物的量相对减少,此时应适当增加引物的使用量。但引物量过大,容易引起非特异扩增,应加以注意。

  6、50 μl PCR反应体系中Template的加入量?

  50 μl PCR反应体系中模板DNA推荐使用量:

  7、PCR产物 (3‘端附有A碱基时) 经末端平滑后,克隆于去磷酸的平滑末端载体时,其PCR产物需不需要5′末端磷酸化?

  需要。一般的PCR用引物5′末端都不带磷 (除非在引物合成时已特别标记)。使用这种引物进行PCR的PCR产物经末端平滑化后,与去磷酸的平滑末端载体连接之前,PCR产物必须进行5′末端磷酸化。

  8、PCR产物需用限制酶进行消化时,需不需要进行Buffer交换?

  在通常情况下,首先须把PCR产物进行纯化后再进行限制酶的酶切反应。但如果只使用PCR反应液的一部分(1~5 μl) 进行酶切反应时,可以不经纯化使用限制酶进行20 μl体系的酶切反应。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/537.html

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