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悬浮细胞转染步骤及优化注意事项(悬浮细胞慢病毒转染步骤)

2022-04-06 10:19:02
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  悬浮细胞是指细胞生长不依赖支持物表面,在培养液中呈悬浮状态生长,如淋巴细胞。在实验室经常会遇到悬浮细胞的转染,其和贴壁细胞转染有很大的不同。

悬浮细胞转染步骤及优化注意事项(悬浮细胞慢病毒转染步骤)

  悬浮细胞转染通常可能遇到:1.效率明显低于贴壁细胞 2.细胞不易培养,死亡率高 3. 转染试剂毒性大,细胞死亡加剧这三种问题,为了提高悬浮细胞的转染效率,可以使用毒性较小的非脂质体的转染试剂,也可以使用电转染方法,提高细胞转染效率,电击对细胞有一定的损伤,最好选用具有细胞膜修复功能的电转染试剂,可以将电击对细胞的伤害降到最低。

  转染过程中,操作步骤一定要谨慎。

  以24孔板siRNA转染为例

  1. 提前1天细胞种植

  悬浮细胞:采用对数生长期的细胞,数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×10^5,那么就用2×10^5的细胞进行转染。

  2. 转染过程

  ⑴ 取0.67μg (50pmol) 的siRNA,加入一定量无血清稀释液,充分混匀,制成RNA稀释液,终体积为25μl。

  注意:无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

  ⑵ 取1μl的Entranster-R4000,然后加入24μl无血清稀释液体,充分混匀,制成Entranster-R4000稀释液,终体积为25μl。室温静置5分钟。

  ⑶ 将Entranster-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上)混合,室温静置15分钟。转染复合物制备完成。

  ⑷ 将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基(可含10%血清和抗生素)的细胞上,前后移动培养皿,混合均匀。

  注意:对本试剂,采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

  ⑸转染后6小时观察细胞状态,如状态良好可不必更换培养基,继续培养24-96小时得到结果。

  注意:1. siRNA转染后,继续培养24-72小时在mRNA水平得到结果,继续培养24-96小时在蛋白水平得到结果。mRNA转染后,根据需要在24小时后得到结果。

  2. 在部分实验室,由于血清和培养条件等差异,转染后镜下培养基中可能出现少量黑点状沉淀,为转染试剂和血清中蛋白结合产物,不影响转染结果和细胞状态,可通过换液除去。

  如遇转染效果不佳,可采取优化方案对实验进行优化:

  1. 优化转染条件包括:转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。

  2. 同时细胞污染也是造成细胞死亡,转染效率低下的一大原因。转染细胞用的质粒必须保证无菌。分享一个小秘诀:将提完质粒后或者提的最后一步,用75%乙醇沉淀,这样就除菌了。

  3. 转染用的质粒首先要保证数量,一般为2μg以上。如果质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他对细胞有毒害作用的物质,需要对质粒进行纯化和浓缩。

  4. 一般进行转染的细胞应该处于对数生长期。如果是贴壁细胞的话,贴壁率应该在70-80%;如果是悬浮细胞的话,应该是6×10^5个/孔(24孔板),一般是转染前一天换液,转染前用无血清培养基或PBS洗细胞一次。

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