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如何设置和监控流式细胞术实验的最佳电压

发布时间:2022-02-23 10:45:37 阅读:17482次 来源:百度学术

  当研究人员第一次坐在流式细胞仪前时,他们面临着几个选择。

  最令人困惑的问题之一是,“我将探测器设置在什么电压?”

  除非研究人员运行的是固定电压系统(Accuri 等),否则这种选择会极大地影响仪器的灵敏度,从而影响实验的成败。

  在模拟流式细胞仪时代,电压是通过在双变量图上放置一个象限门来设置的,左下象限包含第一个对数十年。未染色的细胞将在仪器上运行并设置 PMT 电压,直到这些细胞包含在左下象限内。

设置电压“老派”的示意图

  图 1:设置电压“老派”的示意图。

  由于数据在老一代仪器中的处理方式,一部分人口“超出规模”并在第一个渠道中积累。

  使用这种方法,高度自发荧光的细胞会驱动电压,通常会导致轴上自发荧光较少的细胞受到压缩。然而,由于数据是如何绘制的,这并不总是显而易见的。

  应该记住,使用这些系统,数据在硬件中进行了对数转换(和补偿),并以这种方式存储。这防止了很多收购后的操纵。

  输入数字细胞仪年龄,其中数据在采集后处理。

  数据采集和存储的这种范式变化也意味着需要审查用于设置电压的传统方法并开发新方法。

  1.峰值2优化。

  所有 PMT 都有一个敏感的最佳点:检测器对正在测量的荧光染料发射最敏感的电压。

  Maecker 和 Trotter 于 2006 年发表了第一篇讨论确定电压最佳点的实际应用的论文。在本文中,作者讨论了用于确定灵敏度的所谓“峰值 2”方法。

  在此方法中,非常暗淡的粒子(Spherotech 8 峰珠组的峰 2)在一系列电压上运行,并绘制珠子的方差系数 (CV) 与电压的关系图。

  一个典型的图表如图 2 所示。

PMT 的峰 2 优化结果

  图 2:PMT 的峰 2 优化结果。

  随着 PMT 电压的增加,珠子的 CV 会降低,直到它达到一个拐点,并且从那个点开始,CV 没有任何改善。红色箭头表示“最佳”灵敏度。

  通过识别图表上的拐点(如红色箭头所示)来解释该图表。

  从这一点开始增加电压并不会提高 PMT 灵敏度(需要注意的是,稍后讨论),因此开始时的最佳电压刚好低于该拐点。

  2. 细胞仪设置和跟踪。

  BD 采用了这个想法,并在他们的 Cytometry Setup and Tracking 中实施了不同的方法。

  当运行 CS&T 基线时,通过首先确定电子噪声的标准偏差 (SDEN) 来确定最佳电压。

  软件计算将基线设置为 10X SDEN 所需的电压。该方法的结果存储在 CS&T 报告中,典型曲线如图 3 所示。

CS&T 优化基线报告的结果

  图 3:CS&T 优化基线报告的结果。

  如果你有一台由 BD 以外的任何人制造的数字机器,你能做什么?

  选项一是遵循峰值 2 方法,该方法效果很好。

  第二种选择是测量系统中的电子噪声并通过 CS&T 生成电压。

  测量电子噪声的一种方法是在一定电压范围内运行负粒子(更好的是,未染色的细胞)。然后,生成 (1/mean 2 vs CV 2 ) 图,并计算回归线。

  线的斜率是电子噪声的方差,标准差是方差的平方根。这为您提供了电子噪声的通道值。乘以十得到每个通道的目标值。

  现在将未染色的细胞放在仪器上,调整到目标值,然后离开。

计算 SD EN

  图 4:计算 SD EN。使用 PBMC计算 SD EN的结果在电压系列上运行。

  您可以通过使用针对特定面板使用适当滴定试剂染色的目标细胞执行电压优化来改善这些目标值。

  这有助于提高灵敏度,因为您的面板中感兴趣的荧光染料光谱可能无法使用珠子准确建模。

  如下图所示,两种不同的荧光染料给出了截然不同的结果。

PMT 优化

  图 5:PMT 优化。

  用最佳浓度的 CY7-APC(左)或 BV650(右)抗体标记细胞,并进行电压优化,从低于推荐的峰 2 值开始。

  将分离指数与电压作图,并生成上述曲线。

  特别是对于较新的染料,分离指数的改进确定了这种细胞/荧光染料组合的更好电压。

  3. 设定一致的目标电压。

  在数字仪器上进行电压设置的最后一步是通过某种方式在一段时间内始终如一地设置这些目标电压,而无需经历漫长而乏味的过程。

  珠子又来救场了。在这种情况下,一个非常明亮的珠子(有些人喜欢 8 峰珠子组中的第 6 个峰,但您可以选择自己喜欢的),即在确定最佳电压时运行要使用的通道中的荧光。这会为每个检测器生成一个值——“目标值”。

  然后使用适当的图和目标值设置模板,并记住保存以供以后使用!

  当您回到仪器时,打开模板并运行这个明亮的珠子。调整电压(根据需要)以达到每个通道的目标值,您就可以开始采集样品了。

  这种方法的另一个优点是您可以变得跨平台兼容。

  消除设置电压的恐惧和痛苦的最好方法是使用一些优化方法。如上所述,峰值 2 方法是识别最佳 PMT 电压范围的有用且稳健的方法。用感兴趣的实际细胞和荧光染料将其细化到电压步幅将进一步提高灵敏度,这对于稀有细胞群或紧急抗原(如激活标记)尤其重要。当然,不要忘记设置一种方法来监控和维护这些电压设置。


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