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细胞铺板密度、血清、抗生素分别对转染有什么影响?

发布时间:2022-03-23 10:12:55 阅读:12812次 来源:百度学术

  细胞铺板密度对转染的影响:

  转染试剂成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调,但未成功转染的细胞却不受影响,这时转染效率和总的细胞数量就很重要,一般细胞数量较少时转染效率高,一些试剂由于本身毒性的影响,太低的细胞数量时毒性明显,所以会要求较高的细胞密度(汇合度),顺便说一句,看一个转染试剂的毒性,看它要求转染时的细胞密度就知道了。siRNA的转染和DNA的转染不一样,DNA的转染是过量表达,死亡一些细胞对过量表达的蛋白本身来说影响不大,但siRNA的转染,死亡的细胞所有的基因表达(包括特定目标基因)都下降,将与siRNA造成的特定目标基因的表达下降现象是一致的,将大大影响实验结果。

  选用低细胞毒性的转染试剂其实很重要。由于siRNA沉默时效性的影响,转染后48小时才能进行进行qRT-pcr检测,转染后48-72小时才能进行蛋白检测。如果转染时铺板密度较高,细胞一方面转染效果不理想,直接影响沉默效果和数据可靠性,另一方面,48小时甚至更长时间后,沉默检测最佳点时,过于密集的细胞将影响细胞状态,从而影响实验结果。

  血清对转染的影响:

  血清中含有大量的蛋白质,在转染过程中,带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体对核酸的吸附,影响转染效率。另外,使用脂质体等转染试剂时,由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞,引发细胞毒性,导致转染效率降低,故不能有血清转染。这些转染试剂要求在转染前换无血清培养基,转染后4-6h在更换成有血清培养基,这其实是为了减轻转染造成的细胞毒性。不过如果使用非脂质体的转染试剂,转染过程中就可以加血清,这样也可以提高细胞转染效率。

  抗生素对转染的影响:

  细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染,但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。比如青霉素和链霉素,就是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒,但脂质体等转染试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这可能间接导致细胞死亡,造成转染效率低。所以,使用脂质体转染试剂时培养基中不能使用抗生素,甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。

  对于非脂质体转染试剂,在转染过程中可以添加抗生素,抗生素的添加与否不影响转染效率和毒性。他们是由纳米高分子聚合物组成的物质,分子内含有许多氨基,在生理PH下会发生质子化,这些质子化的氨基可以中和DNA质粒表面的负电荷,使DNA分子由伸展结构压缩为体积相对较小的DNA粒子,并包裹在其中,使DNA免受核酸酶的降解。转染复合物主要是通过细胞内吞作用将DNA转移进入细胞,形成内含体(endosome),DNA从内含体释放,进入细胞质中,再进一步进入核内转录、表达。

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