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细胞计数及活力测定实验怎么做

2023-03-22 10:39:48
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  实验方法原理

  1.培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好,所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

  2.在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞,总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力,由组织中分离细胞一般也要检查活力,以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力,了解冻存和复苏的效果。

  3.用台盼兰染细胞,死细胞着色,活细胞不着色,从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应,也可测定细胞相对数和相对活力。

  实验材料:细胞悬液

  试剂、试剂盒: 台盼兰 四甲基偶氮唑盐 酸化异丙醇

  仪器、耗材:普通显微镜 血球计数板 试管 吸管 酶标仪 分光光度计

  一、细胞计数

  1.  将血球计数板及盖片用擦试干净,并将盖片盖在计数板上。

  2.  将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间。

  3.  静置3分钟。

  4.  镜下观察,计算计数板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算:

  细胞数/ml=4大格细胞总数/ 4×10 000

  注意:镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。

  二、细胞活力

  1.  将细胞悬液以0.5 ml加入试管中。

  2.  加入0.5 ml 0.4%台盼兰染液,染色2-3分钟。

  3.  吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片。

  4.  镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力。

  死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。

  活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

  三、MTT法测细胞相对数和相对活力

  活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比,也与细胞活力呈正比。

  1.  细胞悬液以1 000 rpm离心10分钟,弃上清液。

  2.  沉淀加入0.5-1 ml MTT,吹打成悬液。

  3.  37℃下保温2小时。

  4.  加入4-5 ml酸化异丙醇(定容)。打匀。

  5.  1 000 rpm离心,取上清液酶标仪或分光光度计570 nm比色,酸化异丙醇调零点。

  注意:MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。

  注意事项

  1.镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。

  2.死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。

  3.活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

  4.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。

  其他

  1、0.4%台盼兰染液配制:

  台盼兰 0.4克 加双蒸水至100 ml.

  2、MTT配制:

  MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中,4℃下保存。

  3、酸化异丙醇配制:

  异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L。


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