实验原理

　　鼠胚原代培养是原代培养一个类型，是指从孕鼠中剖取适宜胎龄的胎鼠，从特定组织中分离出细胞，在适宜条件下增殖培养，直到它们占据所有可用的基质（即达到汇合状态）的培养阶段。在此阶段，必须通过将细胞转移到含有新鲜生长培养基的新容器中进行继代培养（即传代），以为其提供更多的继续生长空间。

　　实验步骤

　　1、胚鼠原代培养：

　　1.1 实验前，超净工作台或生物安全柜紫外灯提前照射 30 分钟；

　　1.2 取材:取怀孕母鼠，颈椎脱臼法处死后，整个鼠体浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡 1 分钟。取出母鼠在不锈钢手术盘中用无菌手术剪打开腹腔，取出鼠胚，放入无菌培养皿内。注意取材可在无菌操作台外操作。

　　1.3 用 70-75% 酒精擦拭装有鼠胚的培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗 Hanks 液洗涤鼠胚数遍却除血污。在体视显微镜下进行操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊剖取需要的组织，移入含解离液或培养基的 50 ml 离心管中，用眼科剪将组织剪碎成1立方毫米的肉糜状；

　　1.4 在含组织的 50 ml 离心管中加入解离液或培养基至 10 ml。首先用 10 ml弯头滴管对组织进行吹打 5-10 次，然后用 1 ml 枪头的吹打组织，最后用 200 μl 的尖端进行吹打；

　　1.5 将上述组织悬液通过 70 μm 过滤器过滤切碎和分散的组织悬浮液，然后 l200 rpm， 4℃ 离 10 分钟；

　　1.6 弃掉上清，加入配置好的细胞培养基重悬细胞，接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，将其置于于 37℃、5% CO2 培养箱中，三天后换液，以后每两天换细胞培养液；

　　2、传代培养

　　2.1 实验前，超净工作台或生物安全柜紫外灯提前照射 30 min，开始实验时，酒精擦拭消毒双手；

　　2.2 将原代培养的培养瓶倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代培养；

　　2.3 用酒精棉球擦净操作台，点燃酒精灯，将培养瓶口灼烧消毒；

　　2.4 倒掉培养瓶中的旧培养基，留下贴壁生长的细胞；

　　2.5 在培养瓶中加入适量 0.25 % 胰酶至刚好漫过贴壁生长的细胞即可，拧上瓶盖，将培养瓶置于37℃的培养箱中 5 min。在此期间，如果在显微镜下观察可以看到细胞收回突起变成圆形。

　　2.6 取出培养瓶,轻轻摇晃培养瓶或吹打使细胞脱离瓶壁，将细胞悬液移至离心管中，4℃、800 rpm离心 5 min；

　　2.7 弃掉离心管中的上清，加入细胞培养基重悬细胞植于多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板，再将其置于37℃、5% CO2培养箱中培养，此时细胞可以继续分裂而传代。

　　注意事项

　　1、原代培养注意事项：

　　1）原代培养要重点注意无菌操作，所用器械需提前高压灭菌；

　　2）因为鼠胚原代培养时，获取组织较少，建议在冷光源体视显微镜下操作；

　　3）原代细胞培养过程比较慢,培养时间最少需要一周以上的时间。若 2 天后可能会出现培养基变黄的现象,且无漂浮物,排除污染，属于正常现象,这是因为细胞在贴壁生长过程中释放。