细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。

细胞复苏实验的步骤(细胞复苏的技术原理和操作步骤)

　　[ 实验前准备 ]

　　将无菌培养瓶15 mL离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30 min，以 75%酒精擦拭操作台和双手。

　　离心机调节至800 rpm，5 min。水浴箱调至37 ℃恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。

　　取约10 mL细胞完全培养基放入15 mL离心管中。

　　准备冰盒，快速由液氮中取出冻存的细胞，置于冰盒内。迅速将冻存管投入到已经预热到37 ℃的水浴锅中迅速解冻，不断摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免水进入管中导致污染。整个解冻过程最好在1 min以内完成，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞。

　　待冻存管内液体完全溶解，取出用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。

　　制备细胞悬液

　　以无菌枪头吸取细胞冻存液，用1 ml培养基将冻存管冲洗2次，一并置于已放入细胞完全培养基的离心管中。

　　上下吹打5 次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO的浓度，减轻细胞损伤。以封口膜封好管口。

　　配平离心：采用天平配平两端，800 rpm，室温离心5 min。

　　细胞计数

　　采用罗氏CASY-DT快速细胞计数及活率分析仪进行两次细胞计数，取平均值。

　　加入10 mL CASY-ton 至已标记viable的管中，加入100 ul细胞悬液，颠倒混匀三次，进行细胞计数，可见每毫升悬液中有活细胞2×105个/mL。

　　细胞培养

　　离心后，吸弃上清液，不要吸到底部的细胞沉淀。

　　根据计数结果，向离心管内的细胞沉淀加入 10ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液，吹打过程中尽量不要产生气泡。

　　符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，左右轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀

　　将培养瓶放入37℃，5％ 二氧化碳培养箱中培养，2-4 h或者24-48 h后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定，一般以大部分细胞状态良好时换液为宜，比如超过半数的细胞贴壁，即可换液。

　　注意事项

　　取冻存管要做好保护措施

　　取细胞的过程中未带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮， 解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸,当然，选择好的冻存管此状况一般不会发生。

　　解冻速度要快

　　在常温下，冻存液中的 DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。

　　细胞贴壁少

　　一般冻存细胞解冻时1 mL细胞液要10 mL－15 mL培养液，培养基加入过多，造成细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁，所以进行细胞计数尤为重要。

　　一次复苏细胞不宜过多

　　细胞在解冻时，水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。正规来说，需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。一次复苏细胞过多，容易忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。