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细胞复苏实验的步骤(细胞复苏的技术原理和操作步骤)

发布时间:2022-03-19 10:45:56 阅读:114672次 来源:百度学术

  细胞复苏是将休眠的细胞重新活化,使之重新生长,进入细胞周期,进而分裂产生子细胞的过程。细胞复苏后,可进入细胞周期,重新获得细胞类型特异的生物学功能。

细胞复苏实验的步骤(细胞复苏的技术原理和操作步骤)

  [ 实验前准备 ]

  将无菌培养瓶15 mL离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台,以紫外线照射30 min,以 75%酒精擦拭操作台和双手。

  离心机调节至800 rpm,5 min。水浴箱调至37 ℃恒温。取细胞完全培养基,放于水浴箱中预热。

  取约10 mL细胞完全培养基放入15 mL离心管中。

  准备冰盒,快速由液氮中取出冻存的细胞,置于冰盒内。迅速将冻存管投入到已经预热到37 ℃的水浴锅中迅速解冻,不断摇动,使管中的液体迅速融化,注意管口处高于水面,以免水进入管中导致污染。整个解冻过程最好在1 min以内完成,以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞。

  待冻存管内液体完全溶解,取出用酒精喷拭冻存管的外壁,立即拿入超净台内。

  制备细胞悬液

  以无菌枪头吸取细胞冻存液,用1 ml培养基将冻存管冲洗2次,一并置于已放入细胞完全培养基的离心管中。

  上下吹打5 次,使冻存液与完全培养基充分混匀,尽量减少冻存液中DMSO的浓度,减轻细胞损伤。以封口膜封好管口。

  配平离心:采用天平配平两端,800 rpm,室温离心5 min。

  细胞计数

  采用罗氏CASY-DT快速细胞计数及活率分析仪进行两次细胞计数,取平均值。

  加入10 mL CASY-ton 至已标记viable的管中,加入100 ul细胞悬液,颠倒混匀三次,进行细胞计数,可见每毫升悬液中有活细胞2×105个/mL。

  细胞培养

  离心后,吸弃上清液,不要吸到底部的细胞沉淀。

  根据计数结果,向离心管内的细胞沉淀加入 10ml 细胞完全培养基,反复吹打制成细胞悬液,吹打过程中尽量不要产生气泡。

  符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,左右轻轻摇动培养瓶,把细胞摇均匀

  将培养瓶放入37℃,5% 二氧化碳培养箱中培养,2-4 h或者24-48 h后换液继续培养,换液的时间由细胞情况而定,一般以大部分细胞状态良好时换液为宜,比如超过半数的细胞贴壁,即可换液。

  注意事项

  取冻存管要做好保护措施

  取细胞的过程中未带好防冻手套,护目镜。此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮, 解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸,当然,选择好的冻存管此状况一般不会发生。

  解冻速度要快

  在常温下,冻存液中的 DMSO 对细胞的毒副作较大,因此,必须在一到两分钟内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤。

  细胞贴壁少

  一般冻存细胞解冻时1 mL细胞液要10 mL-15 mL培养液,培养基加入过多,造成细胞浓度过低,不利于细胞的贴壁,所以进行细胞计数尤为重要。

  一次复苏细胞不宜过多

  细胞在解冻时,水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。正规来说,需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。一次复苏细胞过多,容易忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。

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