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细胞转染方法的原理及步骤

2022-12-26 10:25:24
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  细胞转染是将一种物质(通常是 DNA 或 RNA)转移到细胞内的过程。这种方法在研究细胞功能和表型方面非常有用,因为它可以帮助研究人员探究基因在细胞内的作用。

  阳离子脂质体介导的转染

  原理:阳离子脂质体介导的转染是目前最常用的转染方式之一。阳离子脂质的基本结构由带正电荷的头基和一个或两个烃链组成,带正电荷的头基与带负电荷的核酸通过静电作用形成复合物,经细胞的内吞作用进入细胞。

  实验步骤:将DNA,RNA,siRNA或寡核苷酸和转染试剂分别在不同的管中稀释→将两者混合形成混合物→将形成的混合物加入细胞中,脂质体的正电荷有助于帮助复合物粘附到细胞膜上→复合物经细胞内吞作用进入细胞→检测基因表达或沉默情况。

  磷酸钙共沉淀

  原理:将DNA与氯化钙在磷酸缓冲盐水中混合形成磷酸钙-DNA沉淀物,然后将其分散在培养的细胞上,磷酸钙促进共沉淀物中的缩合DNA与细胞表面的结合,DNA通过内吞作用进入细胞。

  实验步骤:将氯化钙和DNA混合,以可控的方式加入磷酸缓冲液。→在室温下孵育,以形成极细,可溶的共沉淀微粒→将磷酸钙-DNA沉淀物加入细胞中,后者能黏附到细胞膜表面→共沉淀物经细胞内吞作用进入细胞→检测基因表达或沉默情况。

  病毒转染

  原理:对于用脂质体不能实现转染的细胞,可以采用病毒转染。腺病毒,逆转录病毒和慢病毒载体已广泛用于哺乳动物细胞体内外的基因转染。

  实验步骤:通过基因克隆方法获得重组病毒表达载体→转染包装细胞系,扩增并分离得到重组病毒颗粒→纯化并滴定病毒液→转导目的细胞(含有病毒特异性的受体)→从培养基中移除病毒→检测基因表达或沉默情况。

  电转

  原理:利用电脉冲在细胞膜上形成暂时的孔使核酸物质能穿过孔进入细胞。

  实验步骤:利用电转缓冲液重悬细胞→对含有核酸,缓冲液,细胞的混合物给予合适的电脉冲→电脉冲在细胞膜上形成电势差,诱导产生暂时的孔使核酸进入细胞→将细胞返回到生长培养基中,使其慢慢恢复→检测基因表达或沉默情况。

  siRNA转染

  RNA干扰(RNAi)现象是由与靶基因序列同源的双链 RNA 引发的,广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。胞质中的核酸内切酶 Dicer 将 dsRNA 裂解成由 21-25 个核苷酸组成的 siRNA,随后 siRNA 与体内蛋白结合形成 RNA 诱导的沉默复合物RISC,RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合,在结合部位切割 mRNA,被切割后的断裂mRNA随即降解,从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。

  用RNAi特异性地抑制如艾滋病病毒基因、肝炎病毒基因、癌基因等相关基因的过度表达,使这类基因保持在静默或休眠状态,这种技术已经成为研究基因功能的重要工具,并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。

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