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组织样本的处理酶解消化法

2022-10-26 10:39:17
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  酶解消化法:

  原理:利用酶(主要是胶原酶和蛋白酶)破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等、水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质和粘多糖物质以将实体组织分散为单个细胞的方法。

  应用:既可用于普通单层的传代细胞也适合致密的组织样本,如上皮、肝、肾等或含有大量结缔组织的肿瘤----食管癌、乳腺癌、皮肤癌等。

  优势:适用于大部分组织样本获取单细胞,酶的种类多选择空间大。

  缺点:操作步骤比较繁琐,消化时间比较长且难控制。不同的组织样本酶种类、浓度、消化时间的选择需要不断摸索优化。

  酶消化法

  1. 胰蛋白酶消化法:适用于消化间质较少的组织,如上皮、肝、肾等组织。

  实例分享:

  将组织块用无钙、镁离子的PBS漂洗干净;

  将组织置于培养皿中,用剪刀剪成小颗粒(1~2mm3);

  加入30倍组织量的酶溶液(0.1%胰蛋白酶和0.02%EDTA等比混合);

  移液管转至50ml离心管中,置于37℃水浴或者恒温箱摇床中,消化20-60min;若需消化较长时间,可每隔15min将2/3的消化上清液转移到离心管中冰浴或离心去除消化液,加入含血清培养基终止消化,另补充新的消化液至离心管中继续消化;

  将消化液或分批收集的细胞悬液经100目的滤网过滤,300g离心5min,弃上清;

  PBS等buffer离心洗涤1~2次;

  染色,过滤准备上机检测。

  2. 胶原蛋白酶消化法:此法适用于分离纤维性组织、上皮及癌组织,即纤维多的硬组织。钙、镁离子不会抑制消化作用,因此可用PBS或含血清培养基配制以提高细胞成活率。

  实例分享:

  将组织块用PBS漂洗干净;

  置于培养皿中,剪成小颗粒(1~2mm3);

  加入30倍组织量的蛋白酶溶液(0.1~0.3μg/ml的胶原蛋白酶);

  移液管转至50ml离心管,置于37℃水浴或者恒温摇床中消化3-48h,后续过程具体方法同胰酶消化法。

  例如:肝癌组织单个核细胞样本制备

  1) 取实体肿瘤组织新鲜标本,迅速在无菌条件下放入RPMI-1640培养基中;

  2) 去除坏死及脂肪组织,选取癌细胞集中和细胞活力较好的部位;

  3) 用锋利的剪刀充分剪碎1-2mm3,将肿瘤组织转移至15-50ml的离心管中;

  4) 看组织体积加入5-6倍的酶解液,37℃摇床消化30-120min左右,(如果用水浴锅消化,每隔5min就拿出来用吸管吹打一下使细胞分离);

  5) 加入等量的含血清的培养基终止消化,用枪头反复吹打以获得单细胞悬液,过100目滤网过滤,去除剩余残渣,收集滤液,300g离心5min。

  TIPs:

  新鲜组织标本应及时进行处理保存,以免组织在室温下放置时间过长(24h内),产生中心组织坏死或者细胞自融,影响FACS测定结果;

  不同的实体组织应选取不同的制备方法;

  酶学法要注意条件的选择和影响因素,同时注意酶的溶剂、消化时间、pH值、浓度等方法对酶消化法的影响;如消化时间太短细胞消化不完全,消化太长会产生损伤;

  如何判断消化成功?如发现组织块已分散而失去块状,经摇动可成为絮状悬液,可取出少量液体在显微镜下观察,可见分散的单个细胞和少量的细胞团,可认为消化充分。

  在使用酶学方法时,应重视酶的选择,如含有大量结缔组织的肿瘤----食管癌、乳腺癌、皮肤癌等,应选用胶原酶消化。

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