资讯动态

细胞培养复苏、传代、冻存步骤讲解

2022-10-26 10:28:00
|
访问量:110892

  复 苏

  细胞复苏的原则:快速融化

  必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。

  实验前准备

  1.将水浴锅提前预热至37℃。

  2.细胞实验室进行常规消毒,用75%酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面,保证无菌。

  3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。

  取出冻存管

  1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。

  2.从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。

  迅速解冻

  1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断地摇动,使管中的液体迅速融化。

  2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内。

  平衡离心

  用架盘天平平衡后,放入离心机中3000r/min 离心3分钟。

  制备细胞悬液

  1.吸弃上清液。

  2.向离心管内加入适量完全培养液,吹打制成细胞悬液。

  3.用培养液悬液混悬沉淀细胞,细胞计数调整细胞浓度,放入培养箱中培养。

  细胞计数

  细胞浓度以5×105/mL为宜。

  培养细胞

  将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃,5%CO2的培养箱内2-4h(或者24-48h)后换液继续培养培养,换液的时间根据细胞情况而定。

  记录复苏日期

  结果分析

  判断细胞复苏成功与否,需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率(细胞存活率将冻存管内剩余的细胞,台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞,活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞,得出细胞存活率)。

  如果复苏后95%以上的细胞贴壁,而且细胞的活性好,这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长,达到正常的生长特性(比如细胞群体倍增时间等)后要再冻存以补充细胞储存数量。

  初学者易犯错误

  ● 水浴锅未提前预热或者未预热到37℃直接融化。

  ● 水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。

  ● 离心前忘记平衡,导致离心机损坏和细胞丢失。

  ● 一次复苏细胞种类过多,忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。

  传 代

  1.传代密度过高

  一旦细胞养太久至融合度过高(>90%)才传代,容易使细胞产生老化现象,甚至是堆叠,再消化细胞时不易吹打成单颗细胞,即便再重新铺盘传代,细胞也无法回到原本的特性了。(如:单层细胞,没长满就发生堆叠现象)

  解决方案

  尽量避免融合度过高,镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。

  细胞融合度:在细胞培养中指的是细胞在培养表面(培养皿/瓶)所占的比例。

  2.传代密度过低

  哺乳动物贴壁培养细胞,若细胞培养到80-90%密度需要开始传代,在传代接种细胞密度过低,细胞间距离太远,就无法在细胞间产生黏附及通信作用,帮助信号传导并活化细胞;总体细胞量不足,分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境,以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。

  解决方案

  细胞传代时,要进行准确的细胞计数,确保铺盘的密度。

  冻 存

  细胞冻存的基本原理:慢冻

  手动降温:将细胞依序放在4℃(30分钟)、-20℃(1小时)、-80℃(过夜)后移至液氮中保存。

  程序降温盒:是一般最广泛使用的降温法,为一种特制冷冻容器(填充异丙醇或依靠特制金属导热),使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃(过夜),然后移至液氮中保存。

  由此可以看出,程序降温精准度更高,优于手动降温。

  细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。

  细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与,而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃时会集体罢工,低温贮藏的目的是通过超低温使代谢活动近乎停止。细胞因此进入休眠状态,使细胞“不会老”,可以长期保存。

  因为冻融过程对所有细胞和组织都是有一定伤害的,因此,需要开发出有效的技术来防止细胞死亡和损伤。

  素材整理于网络,本文只用作知识分享,若有侵权,请联系删除

  • 业务咨询

    业务咨询专线:133 7682 0615

    Email:lxyjy@wie-biotech.com

在线留言(即刻联系为您提供专业的解决方案) ×
留言咨询

感谢您的关注,如有需要请留言,我们会尽快和您联系。