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LDH法细胞活性测定原理和实验步骤

2023-07-06 09:24:43
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  一、原理

  活细胞的胞浆内含有LDH。正常情况下,LDH不能透过细胞膜,当细胞受到NK细胞的杀伤后,LDH释放到细胞外。LDH 可使乳酸锂脱氢,进而使NAD还原成NADH,后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化四氮唑(INT),INT 接受H+被还原成紫红色甲月赞类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定。

  二、仪器和材料

  酶标仪、YAC-1细胞、Hank's液(pH7.2~7.4)、RPMI1640完全培养液、乳酸锂或乳酸钠、硝基氯化四氮唑(INT)、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、NAD、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.2)、1%NP40或2.5%Triton

  三、实验步骤

  1、LDH基质液的配制

  乳酸锂5×10-2mol/L

  硝基氯化四氮唑(INT) 6.6×10-4mol/L

  吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS) 2.8×10-4mol/L

  氧化型辅酶Ⅰ(NAD) 1.3×10-3mol/L

  将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液中(pH8.2)

  2、靶细胞的传代(YAC-1细胞)

  实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hank's液洗3次,用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个 /mL。

  3、脾细胞悬液的制备(效应细胞)

  无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中,用镊子轻轻将脾磨碎,制成单细胞悬液。经200目筛网过滤,或用4层纱布将脾磨碎,或用 Hank's液洗2次,每次离心10min(1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起,加入0.5mL灭菌水20秒,裂解红细胞后再加入0.5mL2倍 Hank’s液及8mLHank’s液,1000rpm,10min离心,用1mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬,用1%冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95%以上),用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上),最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个 /mL。

  4、NK细胞活性检测

  取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50:1),加入U型96孔培养板中;靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL,靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40或2.5%Triton各100μL;上述各项均设三个复孔,于37℃、5%CO2培养箱中培养4h,然后将 96孔培养板以1500r/min离心5min,每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中,同时加入LDH基质液100μL,反应3min,每孔加入 1mol/L的HCl30μL,在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。

  按下式计算NK细胞活性,受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性,即可判定该项实验结果阳性。

  反应孔OD-自然释放孔OD

  NK细胞活性(%)= ────────────────── ×100%

  最大释放孔OD-自然释放孔OD

  四、数据处理及结果判定

  NK细胞活性需进行数据转换,X=Sin-1 ,式中P为NK细胞活性,用小数表示,然后再进行方差分析,在进行方差分析时,需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值< F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。

  五、注意事项

  1、靶细胞和效应细胞必须新鲜,细胞存活率应大于95%。

  2、比色时环境温度应保持恒定。

  3、LDH基质液应临用前配制。

  4、在一定范围内,NK细胞活性与效靶比值成正比。一般效靶比值不应超过100。

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