资讯动态

流式细胞凋亡检测细胞死亡(流式细胞检测细胞凋亡结果怎么看)

2022-03-12 10:23:07
|
访问量:122842

  细胞凋亡,通常称为程序性细胞死亡,是一个经过精心调控的过程,是正常发育和体内平衡的一部分。细胞凋亡在形态和生化上与坏死不同,后者反过来称为意外细胞死亡。细胞凋亡的失调与癌症、自身免疫性疾病和退行性疾病等疾病状态有关。

  细胞凋亡由一系列有序的事件组成,其特征是细胞收缩、细胞通透性增加、膜不对称性的变化、染色质凝聚、DNA 断裂和细胞起泡。最后,通过吞噬作用去除凋亡细胞,组织破坏最小。

  没有一个参数可以完全定义所有系统中的细胞死亡,因此在研究细胞凋亡时使用几种不同的细胞凋亡测定是有利的。流式细胞术的多参数特性允许测量单个样本中的几种凋亡特征,使其成为研究细胞死亡复杂性的有力工具。

  您可以表征早期、中期和晚期的凋亡事件;让我们看一些常规使用的最可靠的细胞凋亡检测方法。

  细胞凋亡中的线粒体变化

  细胞凋亡早期的一个显着特征是线粒体膜电位的崩溃。标记线粒体变化的探针带正电,导致它们积聚在带负电的线粒体内。JC-1 是一种广泛用于细胞凋亡研究的染料;它在活性线粒体中表现出电位依赖性积累,在 488 nm 激发下发出红色荧光。随着线粒体电位的丧失,JC-1 发射从红色变为绿色,并降低了红/绿荧光强度比。这如图 1 所示。比率变化仅取决于膜电位,而不取决于线粒体数量或大小等其他因素。

图1

  DiIC 1 (5) (1,1'3,3,3'3'-hexamethylindocarbocynanine iodide) 是另一种在活性线粒体中积累的带正电荷的染料;它是红色荧光,激发波长为 635 nm,荧光强度随电位降低而降低。DiIC 1 (5) 在别藻蓝蛋白 (APC) 通道中读取,因此很容易与其他试剂进行多路复用。

  MitoTracker™ Red CMXRos是另一种有用的线粒体探针。它在 488 nm 激发下呈现红色荧光,并随着电位的丧失而显示出荧光的减少。MitoTracker™ Red 在藻红蛋白 (PE) 通道中被读取,使其成为另一种易于复用的探针。

  流式细胞术可追踪细胞凋亡的中间事件

  从细胞凋亡的早期阶段到中期阶段,您可以测量半胱天冬酶的激活、细胞膜通透性的变化以及细胞膜不对称性的变化。

  半胱天冬酶依赖性测定

  一系列细胞溶质蛋白酶(称为半胱天冬酶)的激活是细胞凋亡的标志。半胱天冬酶被合成为无活性的半胱天冬酶前体;在细胞凋亡过程中,前半胱天冬酶被蛋白水解激活。可使用多种荧光检测 caspase 活性,包括PhiPhiLux 系统和  CellEvent ™ Caspase 3/7 Green和NucView 488 Caspase 底物。这些可渗透细胞的底物在 caspase 裂解之前基本上是无荧光的。

  FLICA(半胱天冬酶的荧光抑制)也是细胞渗透性的,并与带有荧光标签的半胱天冬酶选择性氨基酸序列共价反应。未结合的 FLICA 扩散出细胞并被冲走。

  膜渗透性测定

  由于细胞膜通透性增加,三种单体花青染料PO-PRO™-1、YO-PRO®-1和TO-PRO®-3进入凋亡细胞。这些染料一旦进入细胞就与核酸结合,而不能渗透细胞的死细胞染色剂(例如碘化丙啶)则被排除在外。上述三种染料具有不同的激发波长,分别为 405 nm、488 nm 和 635 nm,为多路复用提供了灵活性。

  膜对称性测定

  随着细胞凋亡的进展,细胞膜不对称性的丧失发生。磷脂酰丝氨酸(PS)位于活细胞细胞膜的内叶上。随着细胞凋亡的进展,PS 易位或翻转到膜的外叶。用荧光团标记的膜联蛋白 V 通过与外叶上的 PS 结合来识别凋亡细胞。当与不渗透的死细胞染色剂配合使用时,您可以区分活细胞群、凋亡细胞群和坏死细胞群,如图 2 所示。Annexin V 结合取决于缓冲液中钙和镁的存在,因此请务必同时包含两者膜联蛋白 V 测试的阶段。

图二

  紫色比例膜不对称探针F2N12S是一种新型 405 nm 可激发染料,可检测与 PS 翻转相关的表面电荷变化。与 JC-1 类似,F2N12S 给出两个发射波段;活细胞产生橙色发射,随着细胞凋亡而转变为绿色,并且橙色/绿色发射的比率降低。

  细胞凋亡接近尾声的流式细胞术分析

  细胞凋亡的后期涉及核变化,包括染色质浓缩和 DNA 片段化。

  在形态学上,凋亡细胞的细胞核变得比正常细胞的细胞核小,并在用 UV 激发的 Hoechst 33342 或 405 nm 激发的 Vybrant® DyeCycle™ Violet 染料标记时显示出更高的荧光。当与不渗透的死细胞染料配合使用时,您可以使用这些染色质浓缩检测区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞群。

  还可以使用TUNEL 测定法(末端脱氧核苷酸转移酶-dUTP 缺口末端标记)检查细胞凋亡中的 DNA 片段化。该测定基于通过末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 在片段化 DNA 末端掺入修饰的 dUTP。一种新的TUNEL 试剂盒使用点击化学,使用 TdT 在片段化 DNA 的末端掺入炔烃修饰的 dUTP,然后使用铜催化的点击反应与叠氮化物标记的荧光团进行检测。

  流式细胞术成功检测细胞凋亡的技巧

  要在细胞凋亡检测中获得最佳结果,请使用以下提示:

  加入对照总是一个好主意,包括可行的和凋亡的,尤其是在使用新的检测、细胞类型或刺激物时。

  在样品制备过程中,轻轻处理您的细胞,以避免通过操作诱导细胞凋亡。

  为避免检测后细胞凋亡,请在标记后尽快分析细胞。

  活细胞的背景荧光通常比未标记的细胞具有更高的背景荧光。

  请注意,贴壁细胞凋亡的流式细胞术分析提出了独特的挑战,因为细胞去除方法可能会引发错误的凋亡事件。

  将免疫表型与凋亡检测相结合时要小心;抗体可以非特异性结合死细胞,使解释变得困难。在这种情况下,您可以使用最早的细胞凋亡指标。

  最后,尽可能确认形态总是一个好主意。细胞凋亡是一个高度可变的过程;所有细胞类型都没有通用的形态学或生理学特征;建议查看细胞凋亡的多个参数。


  • 业务咨询

    业务咨询专线:133 7682 0615

    Email:lxyjy@wie-biotech.com

在线留言(即刻联系为您提供专业的解决方案) ×