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包慢病毒应注意什么(慢病毒原理及注意事项)

2022-06-16 10:16:08
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  慢病毒介绍

  慢病毒(Lentivirus)载体是以 HIV-1 (人类免疫缺陷1型病毒)为基础,使用疱疹病毒VSVG 外壳蛋白发展起来的工具载体。其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。慢病毒具有感染谱广泛特点,并且可以有效感染分裂和非分裂细胞。一经感染宿主细胞,慢病毒即利用反转录酶将其RNA转录成双链DNA,随后永久的整合到宿主细胞的染色体中,实现长时间稳定表达。 此外,慢病毒免疫原性低,不易造成免疫反应,所以现在慢病毒系统除了被广泛应用到各种细胞系的基因敲除/敲入、基因过表达、RNA干扰、microRNA研究,还大量应用于活体动物实验中。

  慢病毒注意事项

  1、病毒转导至细胞后多久才会表达?

  Lentivirus表达时间较长,但在一般代谢较旺盛的细胞(如293T,HEK293等)上,病毒转导24小时后可以观察到荧光;代谢比较缓慢的细胞(如原代培养细胞,神经干细胞,胚胎干细胞等)荧光蛋白表达时间较长,转导后72-96小时甚至更长时间才可以观察到荧光。转导后的细胞可以连续培养一周,通过观察荧光的表达时间和表达强度来确定病毒对目的细胞的转导情况。

  2、慢病毒对目的细胞的转导效率很低,如何提高病毒的转导效率?

  确保转导之前细胞处于良好的生长状态;可以使用易感细胞如293T进行滴度测试,验证病毒液滴度是否出现大幅下降;适当提高病毒转导的MOI值和延长转导时间。

  3、慢病毒转导后,细胞状态很差甚至出现大量死亡,如何解决?

  转导前细胞状态不佳,加入病毒量太大,病毒携带的目的基因含有细胞毒性均有可能导致目的细胞状态异常,解决方法主要有:

  (1)稳定转导前细胞状态;

  (2)降低病毒加入量,降低MOI值, 验证目的基因的细胞毒性;

  (3)转导6小时后观察细胞,如细胞状态出现异常时更换新鲜培养基,若无则24小时后更换。

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