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细胞被污染了如何预防及挽救!(细菌、真菌污染处理方法)

发布时间:2022-05-06 10:43:45 阅读:135202次 来源:ProteintechGroup

  细胞作为生命活动的基本单位,也是咱们生命科学及医学领域最重要的实验材料之一。因此,培养一窝健康生长的细胞“宝宝”对咱们科研人员而言,是一门必不可少的入门手艺。

  然而做过的人都懂,这细胞培养虽是入门手艺,可一点都不简单呐!分分钟来个污染,尤其是微生物污染,轻则自个儿的细胞废弃,重则连累整个培养箱,甚至培养室!让人头疼不已!

  那么究竟有哪些微生物会造成细胞污染呢?我们又该如何应对?今天小P就和大家一起总结一下~

  微生物污染分类

  一、细菌污染

  细菌污染是细胞培养中最常见的污染,其污染主要来源于实验室环境、实验人员(实验服)、实验用具等,甚至在细胞培养过程中添加抗菌素(一般为预防剂量),也可能因为操作不慎而引起污染。

  种类:造成细菌感染最常见的有革兰氏阳性菌如枯草杆菌、葡萄球菌等;大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌也会造成细菌感染。

  特点:细菌污染的培养液通常会出现浑浊、PH下降,也有少部分会出现培养液肉眼观察无多少改变,只能在镜下发现菌体才知污染情况,建议每天仔细观察;被污染的细胞在显微镜下可以观察到细胞胞浆出现大量颗粒,细胞变圆或者崩溃,从壁上脱落死亡。一般细菌污染进程很快,大约污染一两天后肉眼就能显著观察到变化。

细菌污染

(图片来源于www.dxy.cn)

  二、真菌污染

  真菌污染是细胞培养过程中最常见的另一种污染,尤其在霉雨季节,霉菌污染尤为严重。另外由于真菌可以通过孢子繁殖,因此一旦污染很容易发生扩散。

  种类:常见的真菌感染有烟曲霉菌、黑曲霉菌、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌污染等。

  特点:霉菌污染的细胞培养液短期内一般不会浑浊,可在培养液表面形成白色或黄色漂浮物(斑点状,易于观察);高倍镜下可见明显的丝状、管状或是树枝状的菌丝纵横交错在细胞间;念珠菌和酵母菌污染一般会成卵圆形散在细胞周边,并且酵母菌污染会导致培养液浑浊。真菌污染会与细胞抢夺营养,还会释放次级代谢物毒害细胞,造成细胞活力变差,生长速度变慢,甚至死亡

真菌污染

(图片来源于参考文献3)

  三、支原体污染

  支原体是一种大小介于细菌和病毒之间,并独立生活的原核微生物,广泛存在于人和动物体内。

  种类:细胞培养中常见的支原体有口腔支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体、猪鼻支原体、肺炎支原体和发酵支原体,其中前四者占据支原体污染的绝大比例。

  特点:支原体大小为0.1-0.3µm可以轻易通过我们常用于除菌的0.22µm和0.45µm孔径滤膜;并且在常规光学显微镜下无法观察到,荧光显微镜下可用DAPI染色观察到支原体污染;此外支原体无细胞壁,可以直接且紧密结合宿主细胞细胞膜,适当条件下可能导致细胞融合

  支原体污染具有隐蔽性,他们可以与细胞长期共存培养基一般不浑浊。大部分细胞被污染后似乎无明显变化,但其实支原体会抑制细胞生长,并且导致染色体畸变等,对细胞培养实验影响巨大。


支原体污染

(图片来源于Proteintech)

  四、黑胶虫污染

  黑胶虫是一种生物还是非生物,学术界至今还有争议。这里我们暂且将其认作是一种微生物。黑胶虫污染主要来源于血清

  特点:黑胶虫污染起初对细胞并无影响,当达到一定数量时则会影响细胞生长。受黑胶虫污染的细胞液通常清亮无变化,在高倍显微镜下可以观察到点状片状的游动小体,做布朗运动


黑胶虫污染

(图片来源于参考文献4)

  五、病毒污染

  病毒作为一种比支原体更小的微生物,体型在nm级,很难用常规方法检测到。病毒污染分为外源性和内源性,污染主要来源为细胞系,常见于杂交瘤细胞。

  特点:病毒污染的细胞液通常清亮无变化大部分被污染的细胞也不会产生形态及病理现象,小部分病毒会造成细胞变圆、肿胀、脱落

  病毒污染可用血细胞吸附实验、免疫荧光抗体法以及电子显微镜法检测,但其清除是十分困难的,一旦不幸被污染,建议直接重新引入高质量细胞株

  微生物污染预防

  微生物污染在细胞培养中是非常常见的,也是令人头大的一件事情。所以我们一定要将问题扼杀于摇篮之中,规范实验中的各个步骤,确保细胞“宝宝”在无污染的情况下健康成长。

  1.实验进行前,准备好所需的试剂和器材。玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140℃2小时以上。

  2.培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内,用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天,肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4℃保存。

  3.消化液(pH7.8)或其它加入液,应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌,分装成支置-20℃保存。

  4.超净台紫外灯照射30-60min,并开启超净台风机运转5-10min,然后用75%酒精擦拭超净台台面,再开始实验操作。

  5.实验进行时,佩戴好口罩及手套穿上洁净实验服,有长发则将长发扎起或者佩戴帽子,避免灰尘或唾液进入培养物中。

  6.进入超净台前应用75%酒精对双手及手腕进行全面擦拭,确保除菌完全。

  7.实验用品用75%酒精擦拭后才能放入超净台内。

  8.操作时小心取用无菌物品,应避免污染。勿碰触吸管尖头,不小心碰触后应立即更换;手及物品不要在暴露的瓶口上方来往,容器打开后,倾斜45度操作,操作完成后及时盖上瓶盖。

  9.每次操作只处理一种细胞;即使不同细胞使用相同的培养基也不要共享同一瓶培养基,避免细胞间的交叉污染。

  10.实验用品用完应移出超净台,以利于空气流通;实验完成后用75%酒精擦拭超净台台面

  11.定期清洗或更换超净台过滤膜、预滤网

  12.此外CO2培养箱的清洁是较易被忽视的地方,应1-2个月对培养箱定期进行清洁消毒。先用75%酒精擦拭培养箱内壁、隔板、水盘2-3次,用双蒸水清洗,再用酒精棉球擦拭一遍,最后紫外灯照射1h以上或进行高温高压灭菌处理。水盘内加入无菌水(应每周更换),待培养箱内温度、湿度、CO2浓度稳定后再放入细胞。

  微生物污染去除

  有同学可能会问,细胞已经被污染了怎么办?还能挽救吗?

  首先我们要知道,在任何情况下,完全去除细胞中的微生物污染是非常困难的!因为不管是哪一种操作,对细胞的生长而言都是一种额外刺激,很有可能导致细胞状态改变甚至死亡;而过度使用抗生素可能产生更强抗性的菌株,撤药后极易复发。

  所以,对于易于重新获得的细胞株,我们建议直接处理培养物,不分敌我全部消灭,防止感染扩散!对于极为珍贵的细胞样本,我们可以尝试以下处理方法进行挽救

  一、细菌、真菌污染处理方法

  1. 用DBSS洗细胞(稀释污染物):

  (a). 对于单层细胞,用DBSS浸洗培养物3次,胰蛋白酶消化,通过离心重悬用DBSS再洗细胞2次;

  (b). 对于悬浮细胞,通过离心重悬用DBSS洗培养物5次。

  2. 在新培养瓶以最低可行种植密度再接种。

  3. 加入高浓度抗生素培养基,每2天换液。(一般在正常工作浓度的5-10倍,建议做梯度实验确保对污染物杀伤力较大,对细胞影响较小)

  4. 用高浓度抗生素培养基再培养。

  5. 重复步骤1~4,进行3次再培养。

  6. 去掉抗生素,在无抗生素培养细胞的状况下再进行3次再培养。

  7. 通过相差显微镜检查培养物并进行Hoechst染色。

  8. 在无抗生素的条件下再培养细胞2个月,检查确定所有污染已被移除。

  细胞培养正常抗生素浓度推荐表

细胞培养正常抗生素浓度推荐表

(数据源于参考文献3)

  二、支原体污染处理方法

  1. 用D-PBSA洗涤细胞(稀释可以减少污染物数量):

  (a).对于单层细胞,用D-PBSA浸洗培养物3次,胰蛋白酶消化,通过离心重悬用D-PBSA再洗细胞2次;

  (b).对于悬浮细胞,用D-PBSA离心重悬洗涤细胞。

  2. 以高种植密度接种1个或者多个新培养瓶。

  3. 加入高浓度抗生素培养基,每2天换液。

  4. 用高浓度抗生素培养基再培养,如果不同类型的抗生素与BM-Cyclin交替使用,细胞应在应用新抗生素前换液。

  5. 去掉抗生素,在无抗生素培养细胞的状况下培养细胞至少2周。

  6. 用PCR或者其他支原体检测方法检测培养物。

  7. 在无抗生素的条件下再培养细胞2个月,检查确定所有污染已被移除。

  支原体去除抗生素浓度推荐表

支原体去除抗生素浓度推荐表

(数据源于参考文献3)

  三、黑胶虫污染处理方法

  上面提到黑胶虫污染主要源于血清,故实验时尽量采用质量和口碑较好的血清培养。 黑胶虫早期污染一般采用如下方法:

  1. 用0.25%的胰酶消化,当有少量细胞变圆或脱壁时,用血清终止消化;

  2. 轻轻用培养液或D-Hanks液清洗3遍(缓缓流过细胞表面),不要吹打,吹散细胞;

  3. 换培养瓶培养,隔天换液,2天后重复一次;

  4. 此后每24-36h换液一次,一周后,黑点基本消失。

  述污染去除方案均是在细胞极其珍贵情况下的无奈之举,在细胞易于获得的情况下还是建议大伙儿直接处理掉污染的细胞,重新以新批次细胞进行试验,不仅节约时间,而且风险更小。

  参考文献

  1. 陈思瑶,吴亚猛等. 细胞培养过程中常见的微生物污染及处理方法[J]. 吉林医药学院学报,2016.

  2. 姜彬. 细胞培养技术简介及避免污染的策略[J]. 生物学通报,2008.

  3. R. Lan Freshney著,章静波,徐存拴,等译. 动物细胞培养——基本技术和特殊应用指南(原书第七版).科学出版社,2020.

  4. 周怡婷,高增鸿等,细胞培养中"黑胶虫"污染的检测及防治[J]. 生物化学与生物物理进展,2019.

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1118.html

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