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动物细胞原代培养实验怎么做,详细操作步骤分享

2023-06-10 10:33:37
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  动物细胞培养(animal cell culture)就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞(使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶)然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。

  我们常见的动物细胞培养种类主要分为,原代细胞培养与传代细胞培养,今天我们来看看原代细胞培养的详细步骤!

  原代细胞培养是指将动物各种组织从机体中取出,经各种胰蛋白酶、螯合剂或机械方法处理,分散成单细胞,在合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。培养的细胞为正常的动物细胞,一般培养10代后不再增殖,死亡。

  我们培养动物的原代细胞主要分为取材、漂洗、剪切、消化、制备单细胞悬液、接种、培养等步骤,咱们一个一个看(以小鼠为例):

  1、待培养细胞组织取材

  颈椎脱臼法处死小鼠,放在100ml的烧杯中用70%乙醇消毒3min。用剪刀剪开腹部,取出肾、肝、脾(任意一种脏器)。

  (1)将小白鼠断颈处死,然后用75%酒精或1%新洁尔灭浸泡消毒,迅速进入无菌室。

  (2)将小白鼠置超净工作台上,打开腹腔

  2、清洗组织

  在盛有PBS缓冲液平皿中洗涤数次,剔除包膜、结缔组织,将剔除后的脏器放入另一个盛有PBS的平皿中。

  3、剪切组织

  将肾、肝、脾剪成1mm3(剪成肉末状)大小的组织块,再次清洗,洗去残留的血细胞,以备消化。

  4、消化组织

  (1)在50ml离心筒中加入0.25%胰蛋白酶溶液25ml在温暖的环境中或置于37°水浴摇床中轻轻摇动15min,转速约为180r/min。

  (2)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降,将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中,该管内按照每10ml上清加入Im小牛血清的比例加入生血清以灭活胰蛋白酶。(小牛血清在共用无菌操作台上取用)

  (3)在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化,重复以上1和2步骤。

  5、制备单细胞悬液

  (1)将混合的细胞悬液离心,1200rpm,5min,弃上清。

  (2)将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬,再1000-1200rpm,5min离心。

  (3)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止,然后再按照第一步进行离心,离心后弃去上清液,将沉淀用少量细胞培养液反复吹打,制成细胞悬液。

  6、细胞接种

  (1)将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。

  (2)用滤器过滤细胞培养液再悬沉淀,并使终体积为20ml。

  7、细胞培养

  (1)在培养瓶外做好标记(标明所培养细胞的名称和时间),

  (2)置于CO₂的孵箱中培养,

  (3)72h后即可观察。

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