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质粒提出来浓度很低的原因(质粒提取浓度低的原因是什么)

发布时间:2022-11-28 10:24:10 阅读:14412次 来源:百度学术

  一、细菌离心后,加入溶液蜗旋振荡时,发现菌体呈絮状不易混匀,或成细砂样。————很可能是细菌发生溶菌,可减少培养时间、降低培养温度试试看,通常降低培养温度 会使细菌生长更加稳定;同时也可以试试平板培养,培养后,用PBS将菌落洗下,再进行质粒的提取,固体培养基上细菌生长的要好一些。

  二、加入溶液Ⅱ,菌液浑浊度没有发生明显变化。————裂解不完全,主要问题是发生在溶液Ⅱ上。确保10%SDS是澄清的,确认NaOH是有效的,如使用的是试剂盒,确认溶液I是澄清没有沉淀的。如确认原因不是发生在溶液II上,而是细菌浓度比较高,可相应增加溶液I/III的体积。此外,还有可能是"杂菌"污染。

  三、加入酚仿抽提,离心后在水相和有机相间没有变性蛋白层,但随后的乙醇沉淀发现大量的半透明沉淀,溶解后蛋白浓度高。————乙醇沉淀时,较纯的质粒沉淀应该是白色(PEG纯化的沉淀是透明的,肉眼不易发现),如沉淀是半透明的凝胶状,则是蛋白含量高。出现此类问题时确认两点∶

  1.平衡酚是否被氧化、pH是否是8.0。

  2.溶液III/Ⅲ反应后,离心的上清pH是否在8.0左右。有时,由于溶液Ⅲ配置的问题,导致溶液I/IIL反应后离心的上清pH与8.0偏差较大,导致平衡酚抽提时没有有效的将蛋白抽提出来,有时,离谱的pH会导致水相和平衡酚互溶。

  四、使用酚仿抽提方法,质粒A260/A280的纯度也很好,但酶切不能完全切开。

  1.确认酶的有效性;

  2.平衡酚是否被氧化而呈现棕色,而非正常的黄色;

  3.是否不小心吸入了痕量的酚;

  4.乙醇沉淀后,70%乙醇漂洗的是否充分,残留的盐类会影响酶切;

  5.乙醇漂洗后是否完全干燥,残留的乙醇会影响酶切;

  五、 提取质粒中RNA没有去除。

  ————主要原因是RNase失效,或效率不高。

  建议∶1.更换RNase A,并保证其储存条件是正确的;

  2. 对于手工提取质粒,可单独增加一步去处RNA的步骤,即溶液Ⅲ反应后,离心的上清中加RNase,室温37度去RNA10min~30min,但需要保证你的RNase A是经过失活DNase的,同时较高温度(如50度)会更加快速完全的去除RNA,但本人经验,经过高温处理的质粒质量也不高。

  六、传统手工大提质粒,使用PEG8000纯化的问题。

  ————A.PEG8000不需要灭菌,当然,你要确认你的PEG8000是分子生物学使用级别(我们一直使用的SIGMA的);

  如果PEG8000纯化后的得率很低,需要确认一下∶加入PEG8000前,质粒溶液是否是TE,而不是含有大量其它杂盐得溶液。在PEG8000纯化前,质粒溶液应该是经过乙醇或异丙醇沉淀,且经过70%乙醇漂洗过的;沉淀步骤应在冰上或4度进行。

  C. 关于PEG8000处理后离心看不见沉淀的问题∶PEG8000的沉淀是透明的,有时可以看到沉淀,而有时很难辨出沉淀

  六、 试剂盒提取质粒,质粒浓度不理想的问题。

  ———检查漂洗液,是否配置太久,而且在使用后没有旋紧盖子。

  七、 .培养基、抗生素、质粒提取都没有问题,而细菌菌液提取不到质粒。————可以使用细菌质粒提取试剂盒。

  八、 原先测序鉴定没有问题的细菌,37度摇菌后发现质粒大小或序列出现异常。————这种情况出现的几率较小。常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。

  解决办法∶a.降低培养温度,在20~25度下培养,或室温培养可明显减少发生概率;

  b.使用一些特殊菌株,如Sure菌株,它缺失了一些重组酶,如rec类等,使得质粒复制更加稳定。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1821.html

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