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支原体污染检测方法有哪些

2023-04-20 10:38:13
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  支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2um)并独立生活的微生物.约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性.可为圆形、丝状或梨形。支原体形态多变,在光境下不易看清内部结构。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7.6-8.0),对酸耐受性差。对热比较敏感,对一般抗生素不敏感。

  支原体污染细胞后.培养液可不发生混浊.多数情况下细胞病理变化轻微或不显著,细微变化也可由于传代、换液而缓解.因此易被忽视。但个别严重者,可致细胞增殖缓慢.甚至从培养器皿脱落。

  支原体污染的检测

  a.显微镜观察

  直接取少许培养液滴在载物片上,再盖上盖片观察,支原体在镜下呈黑色微小颗粒,多位于细胞与细胞之间。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等区别开来。

  b.PCR检测(MycoTest™ Kit)

  利用降落聚合酶链式反应技术(TD-PCR)对支原体16S rRNA 基因高度保守区域特异性片段进行扩增检测。如果有支原体污染即可在400~600bp左右能看到一条很亮的条带。

  该方法优点:快速,特异性强适用于一般实验室支原体检测预防。

  c. ERA检测

  用酶促重组等温扩增技术(ERA技术)和单分子荧光检验技术(SM@RT),在恒定温度(37℃)下可对特异基因进行扩增及定性检测,通过实时荧光扩增曲线,在20分钟内即可判断样品中是否含特异基因,检测过程无需开盖,避免气溶胶的产生,结果可靠性大幅度提高。

  d.荧光染色法观察

  用荧光染料与DNA特异地结合,可使支原体内的DNA着色,荧光显微镜下支原体成绿色小点,散于细胞周围或附于细胞表面。

  e.电镜检测

  若条件许可,可用扫描电镜或投射电镜观察。一般在细胞培养48-72小时,细胞接近汇合前,用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。

  f.培养检测

  将细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基,培养14天后观察肉汤培养基有无雾状沉淀,然后取0.5mL加入已冷却到50℃的培养基中,再用琼脂培养基做分离培养,37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。

  处理:市场上有多种支原体清除试剂盒,效果比较好。

  黑胶虫污染

  黑胶虫可以穿透滤膜,也可以通过空气传播,低倍下为黑色点状,高倍下可看见黑色的小虫游来游去,培养液也是不浑的,一般不会太影响,细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好,且观测到的运动物无明显增多,且培养液颜色、透明度无明显变化,可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。

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