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免疫PCR技术与其他常用免疫检测技术相比的优势

发布时间:2022-11-28 10:31:50 阅读:11222次 来源:百度学术

  多年来,研究人员一直依赖免疫检测技术,如蛋白质印迹、流式细胞术和酶联免疫吸附试验 (ELISA) ,但免疫PCR是一种相对较新的方法。通过将酶联免疫 ELISA 与聚合酶链式反应 (PCR) 相结合,免疫 PCR 提供了 较高 水平的检测灵敏度。

  酶联免疫吸附试验

  ELISA 是一种将分子吸附到固体表面(通常是微孔板孔)上的测定。从广义上讲,存在三种不同类型的 ELISA。抗原下降 ELISA 是一种抗原与微孔板结合的方法。相比之下, ELISA 依赖于将适当的捕获抗体吸附到微孔板孔中,然后在用另一种抗体检测之前从样品中吸附抗原。第三种形式,竞争 ELISA,当分析物很小且不能同时与两种不同的抗体结合时较 有用。它通常使用抗原向下设置。ELISA 操作简单,运行相对 简单 ,并且很容易适应高通量筛选。

  聚合酶链反应

  PCR 是一种用于扩增特定 DNA 片段的技术,只需少量的起始材料即可进行。它采用三步循环过程:1) dsDNA 的热诱导变性以分离两条互补链,2) 降低温度以允许 PCR 引物结合,3) 使用 DNA 聚合酶产生目标 DNA 的互补拷贝顺序。在传统 PCR 过程中,扩增的 DNA 在凝胶上运行并用溴化乙锭染色。实时 PCR (rtPCR) ,也称为定量 PCR (qPCR) ,而是将 PCR 产物的产生与荧光强度相关联,在检测发生时生成数据。 rtPCR 灵敏度 较 高,动态范围大。

  免疫 PCR :两全其美

  只要有合适的抗体试剂可用,ELISA 就可以检测任何蛋白质,但是它可能不够灵敏,无法识别低丰度的蛋白质。虽然 rtPCR 提供指数信号放大,但它不能直接用于抗原检测,因为它不使用抗体。免疫 PCR 通过抗体-寡核苷酸偶联物结合了这两种检测形式。您可以将任何类型的 ELISA 转化为免疫 PCR 检测,只需将检测抗体替换为抗体-寡核苷酸偶联物即可。

  例如,典型的ELISA 要求对目标分析物具有特异性的抗体固定在微量滴定板的表面上。通过洗涤去除未结合的抗体,并在封闭步骤之后添加样品。孵育后,洗去 表面 未结合的样品,然后添加第二种分析物特异性抗体。如果使用直接检测方法,该抗体将与检测部分结合,例如酶或荧光染料。相反,间接检测涉及另一轮洗涤步骤,然后添加缀合的抗物种二抗。

  要将具有直接检测的 ELISA 转换为免疫 PCR 测定,只需将第二种抗原特异性抗体替换为抗体- 寡核苷酸偶联物。在洗涤步骤之后,可以通过 rtPCR 扩增和检测 DNA。

  将 ELISA 转化为免疫 PCR 检测

  在开发免疫 PCR 检测时,调整现有的 ELISA 是有效的方法 。应优化测定的每个步骤 max 值 以特定读数,同时 min 背景信号。对于等效ELISA,可能已经知道诸如板包被方法、洗涤缓冲液和封闭溶液的类型、样品孵育步骤的长度和抗体的选择等因素。

  任何免疫测定的成功都取决于抗体试剂的质量,但如果配置正确,免疫 PCR 与其他测定形式相比具有许多优势:

  ●高度灵敏—— 可以检测皮克-飞克量的分析物

  ●只需要少量样品

  ●与血清或尿液等复杂样品兼容

  ●可重现

  ●提供多路复用选项

  ●抗体- 寡核苷酸偶联物的产生

  抗体- 寡核苷酸偶联物的生产成本可能较高,因为传统的偶联方法需要大量的抗体,并且在纯化步骤中会产生重大损失。然而,免疫PCR正变得越来越容易获得,因为目前可以使用市场上的抗体- 寡核苷酸偶联试剂盒、酶联免疫ELSIA 试剂盒等。

  为什么切换到免疫 PCR ?

  与其他免疫检测方法相比,免疫 PCR 提供了较高的灵敏度。这使其成为检测复杂样品中低丰度分析物的有效工具,因为样品材料可以大幅度稀释,从而降低背景影响并提高分析性能。该技术还能提供一致且可重复的数据。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1822.html

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