多年来，研究人员一直依赖免疫检测技术，如蛋白质印迹、流式细胞术和酶联免疫吸附试验 (ELISA) ，但免疫PCR是一种相对较新的方法。通过将酶联免疫 ELISA 与聚合酶链式反应 (PCR) 相结合，免疫 PCR 提供了 较高 水平的检测灵敏度。

　　酶联免疫吸附试验

　　ELISA 是一种将分子吸附到固体表面（通常是微孔板孔）上的测定。从广义上讲，存在三种不同类型的 ELISA。抗原下降 ELISA 是一种抗原与微孔板结合的方法。相比之下， ELISA 依赖于将适当的捕获抗体吸附到微孔板孔中，然后在用另一种抗体检测之前从样品中吸附抗原。第三种形式，竞争 ELISA，当分析物很小且不能同时与两种不同的抗体结合时较 有用。它通常使用抗原向下设置。ELISA 操作简单，运行相对 简单 ，并且很容易适应高通量筛选。

　　聚合酶链反应

　　PCR 是一种用于扩增特定 DNA 片段的技术，只需少量的起始材料即可进行。它采用三步循环过程：1) dsDNA 的热诱导变性以分离两条互补链，2) 降低温度以允许 PCR 引物结合，3) 使用 DNA 聚合酶产生目标 DNA 的互补拷贝顺序。在传统 PCR 过程中，扩增的 DNA 在凝胶上运行并用溴化乙锭染色。实时 PCR (rtPCR) ，也称为定量 PCR (qPCR) ，而是将 PCR 产物的产生与荧光强度相关联，在检测发生时生成数据。 rtPCR 灵敏度 较 高，动态范围大。

　　免疫 PCR ：两全其美

　　只要有合适的抗体试剂可用，ELISA 就可以检测任何蛋白质，但是它可能不够灵敏，无法识别低丰度的蛋白质。虽然 rtPCR 提供指数信号放大，但它不能直接用于抗原检测，因为它不使用抗体。免疫 PCR 通过抗体-寡核苷酸偶联物结合了这两种检测形式。您可以将任何类型的 ELISA 转化为免疫 PCR 检测，只需将检测抗体替换为抗体-寡核苷酸偶联物即可。

　　例如，典型的ELISA 要求对目标分析物具有特异性的抗体固定在微量滴定板的表面上。通过洗涤去除未结合的抗体，并在封闭步骤之后添加样品。孵育后，洗去 表面 未结合的样品，然后添加第二种分析物特异性抗体。如果使用直接检测方法，该抗体将与检测部分结合，例如酶或荧光染料。相反，间接检测涉及另一轮洗涤步骤，然后添加缀合的抗物种二抗。

　　要将具有直接检测的 ELISA 转换为免疫 PCR 测定，只需将第二种抗原特异性抗体替换为抗体- 寡核苷酸偶联物。在洗涤步骤之后，可以通过 rtPCR 扩增和检测 DNA。

　　将 ELISA 转化为免疫 PCR 检测

　　在开发免疫 PCR 检测时，调整现有的 ELISA 是有效的方法 。应优化测定的每个步骤 max 值 以特定读数，同时 min 背景信号。对于等效ELISA，可能已经知道诸如板包被方法、洗涤缓冲液和封闭溶液的类型、样品孵育步骤的长度和抗体的选择等因素。

　　任何免疫测定的成功都取决于抗体试剂的质量，但如果配置正确，免疫 PCR 与其他测定形式相比具有许多优势：

　　●高度灵敏—— 可以检测皮克-飞克量的分析物

　　●只需要少量样品

　　●与血清或尿液等复杂样品兼容

　　●可重现

　　●提供多路复用选项

　　●抗体- 寡核苷酸偶联物的产生

　　抗体- 寡核苷酸偶联物的生产成本可能较高，因为传统的偶联方法需要大量的抗体，并且在纯化步骤中会产生重大损失。然而，免疫PCR正变得越来越容易获得，因为目前可以使用市场上的抗体- 寡核苷酸偶联试剂盒、酶联免疫ELSIA 试剂盒等。

　　为什么切换到免疫 PCR ？

　　与其他免疫检测方法相比，免疫 PCR 提供了较高的灵敏度。这使其成为检测复杂样品中低丰度分析物的有效工具，因为样品材料可以大幅度稀释，从而降低背景影响并提高分析性能。该技术还能提供一致且可重复的数据。