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贴壁细胞的复苏、传代及冻存实验具体操作步骤

发布时间:2023-05-22 10:33:58 阅读:12612次 来源:百度学术

  一复苏、传代

  1、准备

  无菌超净台,酒精灯,75%酒精喷壶,CO₂培养箱,37℃水浴锅,离心机,细胞培养瓶,基础培养基、含10%胎牛血清的完,全培养基以及磷酸盐缓冲液PBS(提平衡至室温),0.25%胰蛋白酶,无菌工作服,口罩,手套,记号笔。

  2、步骤

  (1)穿好无菌工作服,带上口罩和手套,快速从液氮罐里取出冻存管,快速放进37℃水浴锅缓慢摇晃使其在1min内全部融化,注意冻存管的封口膜不要破裂,防止污染。

  (2)解冻后用棉球擦干冻存管表面的水滴,酒精喷壶喷洒适量75%酒精消毒冻存管封口处。

  (3)打开超净台(紫外灭菌30min),点燃酒精灯燃烧片刻后,冻存管放超净台,小心打开冻存管,避免污染。接下来有两种处理方式:

  A.无菌吸管将1ml细胞全部吸出至15ml无菌EP管,补加9ml基础培养基稀释,1000rpm离心5min使细胞沉淀,弃上清。加入新鲜配制的含10%血清的培养基10ml,轻轻混匀,用吸管将细胞移至25T培养瓶。平躺放置培养瓶,置于37℃、5%CO₂培养箱培养。培养24h后,显微镜观察细胞(贴壁细胞)贴壁后,小心更换培养基,继续培养,根据不同细胞的生长状态进行传代培养。

  B.无菌吸管将1ml细胞全部吸出至25T培养瓶,补加10ml新鲜配制的含10%血清的完,全培养基混匀。平躺放置培养瓶,置于37℃、5%CO₂培养箱培养。隔天待细胞贴壁之后置换新鲜完,全培养基,继续培养,根据不同细胞的生长状态进行传代培养。

  (4)细胞长满90%~100%即可传代,小心打开培养瓶,瓶口过酒精灯消毒,弃培养基。

  (5)加入1~2mlPBS,润洗细胞,弃PBS,重复3次。

  (6)加入1~2ml0.25%胰蛋白酶消化细胞使细胞脱落。用无菌吸管加入5ml完,全培养基,吹打混匀。

  (7)转移1/2细胞液至新的培养瓶,各瓶补加完,全培养基5ml,混匀。

  (8)小心封口,平躺放置培养瓶,置于37℃、5%CO₂培养箱培养。

  (9)待长满后,按同样的方法传代培养。

  二冻存

  当不需要使用细胞或者细胞量足够时,可以将细胞冻存起来,供以后实验用。

  1、准备

  细胞冻存液(20%血清、10%DMSO、70%基础培养基),梯度降温盒或冰箱。

  2、步骤

  (1)选取活力好,密度约70%细胞用于冻存,此时细胞处于对数生长,期,适合用于冻存。

  (2)细胞经胰酶消化后,转移至无菌EP管,1000rpm离心5min。

  (3)弃上清,加入新鲜配制的细胞冻存液,25T细胞可以加入1~2ml细胞冻存液,分装1~2个冻存管,细胞,佳密度为5*10的6次方~1*10的7次方个/ml,做好标记。

  (4)冻存的两种方式:

  A.将冻存管放入梯度降温盒(提平衡至室温)。将梯度降温盒放入-80℃冰箱过夜,第二天取出冻存管,快速放入液氮保存。

  B.冻存管置于4℃30min→(-20℃90min)→-80℃16~18h(或隔夜)→转入液氮长,期储存。


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/2351.html

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