一复苏、传代

　　1、准备

　　无菌超净台，酒精灯，75%酒精喷壶，CO₂培养箱，37℃水浴锅，离心机，细胞培养瓶，基础培养基、含10%胎牛血清的完,全培养基以及磷酸盐缓冲液PBS（提平衡至室温），0.25%胰蛋白酶，无菌工作服，口罩，手套，记号笔。

　　2、步骤

　　（1）穿好无菌工作服，带上口罩和手套，快速从液氮罐里取出冻存管，快速放进37℃水浴锅缓慢摇晃使其在1min内全部融化，注意冻存管的封口膜不要破裂，防止污染。

　　（2）解冻后用棉球擦干冻存管表面的水滴，酒精喷壶喷洒适量75%酒精消毒冻存管封口处。

　　（3）打开超净台（紫外灭菌30min），点燃酒精灯燃烧片刻后，冻存管放超净台，小心打开冻存管，避免污染。接下来有两种处理方式：

　　A.无菌吸管将1ml细胞全部吸出至15ml无菌EP管，补加9ml基础培养基稀释，1000rpm离心5min使细胞沉淀，弃上清。加入新鲜配制的含10%血清的培养基10ml，轻轻混匀，用吸管将细胞移至25T培养瓶。平躺放置培养瓶，置于37℃、5%CO₂培养箱培养。培养24h后，显微镜观察细胞（贴壁细胞）贴壁后，小心更换培养基，继续培养，根据不同细胞的生长状态进行传代培养。

　　B.无菌吸管将1ml细胞全部吸出至25T培养瓶，补加10ml新鲜配制的含10%血清的完,全培养基混匀。平躺放置培养瓶，置于37℃、5%CO₂培养箱培养。隔天待细胞贴壁之后置换新鲜完,全培养基，继续培养，根据不同细胞的生长状态进行传代培养。

　　（4）细胞长满90%~100%即可传代，小心打开培养瓶，瓶口过酒精灯消毒，弃培养基。

　　（5）加入1~2mlPBS，润洗细胞，弃PBS，重复3次。

　　（6）加入1~2ml0.25%胰蛋白酶消化细胞使细胞脱落。用无菌吸管加入5ml完,全培养基，吹打混匀。

　　（7）转移1/2细胞液至新的培养瓶，各瓶补加完,全培养基5ml，混匀。

　　（8）小心封口，平躺放置培养瓶，置于37℃、5%CO₂培养箱培养。

　　（9）待长满后，按同样的方法传代培养。

　　二冻存

　　当不需要使用细胞或者细胞量足够时，可以将细胞冻存起来，供以后实验用。

　　1、准备

　　细胞冻存液（20%血清、10%DMSO、70%基础培养基），梯度降温盒或冰箱。

　　2、步骤

　　（1）选取活力好，密度约70%细胞用于冻存，此时细胞处于对数生长,期，适合用于冻存。

　　（2）细胞经胰酶消化后，转移至无菌EP管，1000rpm离心5min。

　　（3）弃上清，加入新鲜配制的细胞冻存液，25T细胞可以加入1~2ml细胞冻存液，分装1~2个冻存管，细胞,佳密度为5*10的6次方~1*10的7次方个/ml，做好标记。

　　（4）冻存的两种方式：

　　A.将冻存管放入梯度降温盒（提平衡至室温）。将梯度降温盒放入-80℃冰箱过夜，第二天取出冻存管，快速放入液氮保存。

　　B.冻存管置于4℃30min→(-20℃90min)→-80℃16~18h(或隔夜)→转入液氮长,期储存。