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蛋白酶抑制剂 101:它们的工作原理和使用方法

2022-04-22 10:42:46
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  蛋白酶抑制剂广泛用于分子生物学实验室。继续阅读以了解为什么需要它们、如何安全使用它们以及如何正确存储它们。

  有问题的蛋白酶

  蛋白酶存在于所有生物体中。它们破坏蛋白质中的肽键,并参与多种细胞过程和途径,从简单到复杂。

  没有它们,你的血液就不会凝结。细胞凋亡,即细胞在正常条件下翻转的过程,将停止发生。胃蛋白酶和胰蛋白酶无法帮助我们消化美味的富含蛋白质的食物。

  最糟糕的是,您可能无法去除衣服上的污渍,因为蛋白酶是许多洗衣粉中的常见添加剂(喘气)!

  撇开所有的玩笑不谈,蛋白酶显然对于细胞正常运作至关重要。正如我们所知,这一切都对生命有益,但在实验室中表达和纯化蛋白质时,蛋白酶可能是一个主要的痛苦。

  每当您裂解细胞时,控制天然蛋白酶的区室化和抑制作用就会被打破,您会对您感兴趣的珍贵蛋白质造成潜在的破坏。

  为什么蛋白酶在细胞裂解过程中是个问题?

  细胞裂解会破坏细胞膜,包括那些隔离蛋白酶的细胞膜,在正常新陈代谢过程中细胞会仔细检查这些细胞膜。在该屏障消失后,您的细胞系表达的任何蛋白酶都可以自由地开始作用于溶液中的其余游离蛋白质。

  添加蛋白酶抑制剂作为裂解缓冲液的成分意味着您甚至可以在裂解过程中细胞膜破裂之前采取预防措施。

  即使您不知道存在多种蛋白酶抑制剂,如果细胞裂解是您工作的典型部分(我在看着您,EDTA!),您也可能至少使用过其中的一种或两种。 .

  现在我们知道了为什么需要蛋白酶,让我们看看它们是如何工作的。

  什么是蛋白酶抑制剂以及它们如何工作?

  蛋白酶抑制剂不是结构相关的分子家族。相反,蛋白酶抑制剂是由它们的功能定义的:它们抑制蛋白酶,正如它们的名字所暗示的那样。

  从技术上讲,蛋白酶抑制剂包括与蛋白酶结合以可逆或不可逆地抑制其功能的任何化学或生物化合物。它们的大小和分子量差异很大,分类包括小化学品、肽,甚至其他蛋白质。

  蛋白酶抑制剂可按多种方式分类。当您购买蛋白酶抑制剂时,您会发现它们通常按其抑制的蛋白酶类型进行分组。但是,我们可以根据它们是可逆的还是不可逆的抑制剂对它们进行广泛的分类。

  可逆抑制剂

  可逆抑制剂通过非共价相互作用与酶的活性位点结合。可逆蛋白酶抑制剂的一个很好的例子是抑肽酶,它通过与天然底物竞争活性位点来抑制大多数丝氨酸蛋白酶。为了使可逆蛋白酶抑制剂发挥良好作用,您必须确保使用适当浓度的抑制剂,以便它能够有效地胜过天然蛋白酶底物(您宝贵的蛋白质!)。

  可逆抑制剂

  相反,不可逆抑制剂以永久阻止功能的方式与活性位点结合。例如,E-64 是一种环氧化物,可共价修饰半胱氨酸蛋白酶中参与亲核攻击的活性位点半胱氨酸,从而使蛋白酶永远失活,并且无法分解任何将来会被切断的肽。

  在这两组蛋白酶抑制剂中,对各种蛋白酶的亲和力范围很大。值得庆幸的是,大多数常见的蛋白酶抑制剂都有建议的工作浓度范围,并且它们的机制已为科学界所熟知——在选择用于工作的抑制剂时让您的生活更轻松!

  常用蛋白酶抑制剂

  对单个蛋白酶抑制剂的工作原理有深入的了解,即使您决定使用鸡尾酒疗法,也可以为它们的使用奠定坚实的基础——其中大多数包括以下最常见蛋白酶抑制剂的某种组合(表 1)。

  表 1。实验室常用的蛋白酶抑制剂、作用靶点和工作浓度。

表 1。实验室常用的蛋白酶抑制剂、作用靶点和工作浓度。

  选择正确的抑制剂:鸡尾酒的重要性

  可是等等!在我们的裂解工作流程中,我们如何选择一种能够防止所有蛋白酶降解蛋白质的灵丹妙药蛋白酶抑制剂?事实是,没有一种蛋白酶抑制剂可以使所有已知的蛋白酶失活。

  当目标是从已经纯化的蛋白质中去除标签时,通常使用单一蛋白酶。在大多数其他需要广泛作用于天然蛋白酶的情况下,几种蛋白酶抑制剂的“鸡尾酒”将起到作用,并且是一种流行的选择。这些鸡尾酒以浓缩溶液的形式制备,有时甚至作为方便的片剂制备。

  大多数市售鸡尾酒是六种抑制剂的组合:AEBSF、抑肽酶、Bestatin、E-64、Leupeptin 和 Pepstatin A。添加 EDTA 后,在大多数细胞裂解和纯化中,广效鸡尾酒几乎涵盖了您的所有碱基工作流程(EDTA 通常被建议为可选,因为它可能会干扰某些实验)。

  鸡尾酒是一种特别方便、便宜且可靠的抑制蛋白酶的方法,在实验室中非常受欢迎。请参阅供应商的数据表和协议,以决定添加到裂解缓冲液中的鸡尾酒量。

  在实验室中使用蛋白酶抑制剂时的注意事项

  在您决定在工作中使用蛋白酶抑制剂时,请牢记以下几点。

  贮存

  几种蛋白酶抑制剂在室温下或什至在冷藏条件下长时间保存时特别不稳定。此外,蛋白酶抑制剂的稳定性随其工作(或 1x)浓度而变化。

  但是,只要您根据供应商的指示适当地存储抑制剂,它们就应该在您准备好使用它们时按预期发挥作用。一个例外是 PMSF,它可能需要多次添加才能阻止蛋白酶。

  安全

  虽然大多数蛋白酶抑制剂被认为在标准微生物实验室 PPE中通常是安全的,但也有一些特殊情况。一些抑制剂在有机溶剂和乙酸中制成浓缩物。

  PMSF 是一种神经毒素,应在通风橱中处理。

  底线:始终查看您在实验室中使用的任何新试剂的安全数据表,包括市售的蛋白酶抑制剂。

  与您的工作流程的兼容性

  虽然几种蛋白酶抑制剂相当具体地针对某些类别的蛋白酶,但在某些情况下,您可能希望排除某些不适合您工作中下游活动的抑制剂。

  例如,EDTA 是一种极好的金属蛋白酶抑制剂,因为它能够螯合金属蛋白酶在其活性位点催化蛋白水解所需的二价阳离子。但 EDTA 也会去除蛋白质纯化柱中的镍,这些柱子通常用于纯化带His 标签的蛋白质。

  其他蛋白酶抑制剂在极端 pH 值或温度下不起作用。

  一般来说,您可能会通过咨询供应商提供的蛋白酶抑制剂说明,包括如何最好地处理和使用您选择的抑制剂,来获得一个良好的开端。

  您是否经常在工作中使用蛋白酶抑制剂,或者有提示或其他建议?在下面的评论中让我们知道,并快乐抑制!


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