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软琼脂法实验服务周期及流程(如何作好软琼脂实验分析)

2023-04-23 10:23:25
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  软琼脂法实验服务周期及流程

  软琼脂法实验是一种测定细胞转化及致瘤性的实验方法。该实验需要细胞锚定非依赖性生长状态(肿瘤细胞生长特性)。相比于2D单层培养,该3D培养法的生长条件可以更准确地反映出癌细胞的自然生长环境,因此动物实验进行之前的软琼脂法实验是至关重要的。 实验前,将细胞(用致癌物质或致癌物抑制剂处理的)于软琼脂培养21-28天。而后,克隆子可经细胞染色法进行形态学分析并且计数。

图例

  实验流程:

  1. 基层琼脂

  2. 在基层琼脂上加入细胞琼脂,培养6-8天

  3. 形成克隆子

  4. 溶解琼脂(形成均质细胞悬液)

  5. 细胞溶解并检测

  如何作好软琼脂实验分析?

  软琼脂(soft agar)实验一般用来检测细胞的集落形成能力。现在这种方法越来越多的用于分离癌细胞,也可以用来确认癌细胞是否具有癌化特性,为进一步做肿瘤小鼠移植 模型奠定理论基础。该方法看似简单,但如果细节掌握不好,往往导致实验失败或数据缺乏说服力。如果你曾经在这个实验上栽了跟头,请不妨在如下几个方面进行 尝试:

  1.要确保在整个实验过程中所使用的琼脂处于完全液体状态(>80℃),尤其是在做基底时,如果琼脂凝固过快会导致基底不均一;

  2. 做琼脂基底是应避免产生小气泡,一旦有小气泡产生,应该立即将气泡赶走;

  3. 应使用2倍浓度的培养基,并加入20%FBS 和2%的P/S;

  4. 在制备上层时,混合液体需要有顺序,一般为在同一个移液管中先吸取液态琼脂,再吸取同体积的2倍浓度的培养基,最后在吸取2倍体积的细胞悬液,这样既可以保证琼脂不立即固化,又可以有效避免细胞因温度过高而烫死;

  5. 因为该实验周期较长,为避免过度蒸发而导致琼脂裂解,需要保证小环境持久湿润,一般可在六孔板或培养皿下面垫上三到四层湿润的薄纸。

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