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稳转细胞株可以稳定传多少代

2023-04-23 10:36:33
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  随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展,转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中,其应用越来越广泛。

  1. 转染的分类:物理介导、化学介导和生物介导三类途径。

  物理介导:电穿孔法、显微注射和基因枪法;

  化学介导:经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;

  生物介导:较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

  2. 三种转染方法具体介绍:

  电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入(实验条件控制较严、难度较大);

  脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞(常用,质体与质粒的比例,细胞密度,转染的时间长短和培养基中血清的含量都影响转染效率);

  病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞(前期准备较复杂、对细胞可能有较大影响);

  3.质粒:真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位。

  包括真核生物的细胞器(主要指线粒体和叶绿体)中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。

  在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector),质粒上常有抗生素的抗性基因,例如氨苄抗性基因或 卡那霉素 抗性基因等。

  4.病毒转染:外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。可用于RNAi,cDNA克隆以及报告基因的研究,稳转细胞株的筛选,为活体动物模型实验。

  慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成,即包装成分和载体成分。前者能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白;后者同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

  步骤: 1 )构建载体 2 )包装提纯病毒 3 )感染靶细胞

  为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高水平的表达效应分子。

  5. 质粒转染和病毒感染异同:

  (1)质粒转染:相对简单的基因传递方式,与病毒载体主动进行细胞攻击侵染方式不同,质粒转染属于被动扩散。

  优点:质粒载体构建流程相对简单,速度快(病毒载体都需要先构建载体后包装成病毒颗粒)

  缺点:a.在细胞水平,质粒转染效率不稳定,不同细胞依照不同的转染方法和转染介质,效率差别较大,且大部分方法效率不高;

  b.质粒转染一般入核效率低,特别是阳离子脂质体,阳离子聚合物等介质,电转质粒入核的效率则比介质转高不少,但比起慢病毒转染,效率仍然低很多,且对细胞损伤较大。

  (2)病毒载体转染:病毒粒子是病毒壳(介导细胞转导/引入整合酶/介导体内靶向转导)+目的基因的复合物,不用或者用简单的试剂就能完成基因导入。

  优点:转染效率高,应用不同的病毒载体工具可实现细胞和动物的高效转导和稳定转导。

  缺点:不同的病毒载体的包装需要比较复杂流程和工艺优化,相对技术门槛较高。

  稳转细胞株可以稳定传15代,稳转细胞株由于基因是通过病毒载体随机插入到目的细胞的基因组中,所有并不是稳定的拷贝数也不是均匀的分布,可以在后续的细胞传代中,拷贝数会不断稀释,导致基因表达量逐步的下降,特别是在传代超过15代之后,更是如此,此事加药物也不一定能够稳定表达,所以稳转细胞株可以稳定传15代。

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