细胞免疫荧光实验注意事项盘点

　　1、建议细胞直接种孔板，采用倒置荧光显微镜拍照，这样可以避免最后挑片时造成划片或细胞片破损以及最后封片可能造成滑片等结果；

　　2、若实验室只有正置荧光显微镜，则需要将细胞植于细胞爬片。

　　1）建议直接购买处理过的细胞爬片；

　　2）若只有普通细胞爬片，可以先将爬片于浓酸（浓酸腐蚀性强，注意操作）或 75% 乙醇浸泡过夜，若用酸浸泡过夜，第二天先用自来水小心冲洗掉爬片残留的酸液，若用 75% 乙醇浸泡，则不需要此步骤。

　　然后，用洗洁精搓洗爬片，最后用去离子水清洗爬片。置于烘箱 80℃ 烘干，再将爬片置于超净台造紫外消毒后备用；

　　3、根据所检测抗原所在位置来确认是否需要加入 Triton 进行通透。若所检测抗原表位位于膜蛋白的白外段，则不需要通透；

　　4、一般5% BSA 封闭即可达到效果；

　　5、从加荧光二抗起，后面所有操作步骤尽量避光。

　　6、 缩短在荧光显微镜下的观察时间，1-2 h 为宜。

　　7、染色后尽快荧光显微镜下观察，若不能可放入 4℃ 冰箱避光保存一周。

　　8、无/弱染色：烤片温度过高，推荐56℃-60℃ 1-2 h；一抗是否适用固定液和石蜡切片，使用浓度是否过低，孵育是否时间过短等。

　　9、非特异性染色：是否灭活内源性过氧化物酶；孵育过程中干片；抗原热修复过度。

　　10、染色过深：一抗浓度过高；染色试浓度过高或孵育时间过长；染色剂浓度过高或孵育时间过长。

　　11、通常实验室先固定细胞再进行通透，但若检测抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，这样可以通过通透去除一些水溶性蛋白，进而可降低免疫荧光背景和非特异性信号；

　　12、建议设阴性对照组，消除由于抗体非特异性结合而产生的背景染色；

　　13、选择醛类固定液时，保持其新鲜度，最好现配现用，使用不新鲜的醛类固定液自发荧光背景会升高；