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凋亡细胞Annexin-Ⅴ-FITC单染法

发布时间:2023-04-04 10:37:45 阅读:13552次 来源:百度学术

  细胞凋亡或称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),是细胞的生命现象之一,在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生,如肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死,它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变,包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

  Annexin-Ⅴ-FITC单染法

  【实验原理】

  正常活细胞的磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,而凋亡细胞的PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-Ⅴ)是一种相对分子质量为35000~36000的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合。因此,将Annexin-Ⅴ进行荧光素(如FITC、PE)或生物素(Biotin)标记,以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

  【材料和仪器】

  1.500μl或250μl20μg/mlAnnexin-Ⅴ-FITC(膜联蛋白-Ⅴ-FITC)。

  2.40ml或20ml标记缓冲液(Binding Buffe)。

  3.60ml或30mlPBS(1×)、去离子水、冰块。

  4.20μl、200μl及1000μl移液器和吸头、微量离心管、盖玻片(用于荧光显微镜观察)。

  5. 可调速离心机、载玻片(用于荧光显微镜观察)、流式细胞仪或荧光显微镜。

  【实验方法】

  1. 凋亡细胞的制备:小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重,10h后解剖取胸腺,分离胸腺细胞。用PBS洗两遍,调整细胞浓度为2×106/ml,备用。

  2. 取200μl细胞悬液加入1ml冷PBS,轻轻震荡使细胞悬浮,1000r/min4℃离心10min,弃上清,共三次。

  3.将细胞重悬于200μl标记缓冲液中。

  4.加入10μlAnnexin-Ⅴ-FITC,轻轻混匀,避光室温反应15min或4℃反应30min。

  5.加入300μl标记缓冲液,立即镜检或上机(流式细胞仪)检测。

  【实验结果】用荧光显微镜观察,凋亡细胞细胞膜上可见黄绿色光环(图14-1)。用流式细胞仪分析可检测凋亡细胞的百分率。

图例

  图14-1 凋亡细胞的Annexin-Ⅴ-FITC单染法结果

  【注意事项】

  1. 整个操作过程动作要尽量轻柔,切勿用力吹打细胞,尽量在4℃下操作。2.反应完毕后要尽快检测,因为细胞凋亡是一个动态的过程,反应1h后荧光强度就开始衰变。3.Annexin-Ⅴ-FITC是光敏物质,在操作时要注意避光。


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/2191.html

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