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流式鉴别细胞死活方法,如何解决死细胞的问题

2023-04-05 10:37:06
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  为什么要鉴别细胞死活?

  流式细胞术是一个容易被死细胞所干扰的技术,因为:

  1. 死细胞容易摄取抗体和探针,导致明显的非特异性染色。

  2. 死细胞自发荧光特别强。最后导致背景荧光增强,使得我们无法观察到一些标记的弱阳性表达。

  3. 死细胞还可能会释放DNA,DNA非常粘稠,所以最后会导致细胞成团,既影响结果,又容易堵塞管路。在流式分选中,一般都不愿意分选活力不好的细胞。

  如何解决死细胞的问题?

  我们需要确保细胞的培养基中含少量DNAse,以保证细胞单个存在,不被死细胞产生的DNA影响而粘附在一起。

  利用死细胞的一些特性来区分活细胞与死细胞。当细胞死亡时,它们就会失去膜完整性,膜的渗透性增强,这就是为什么我们在标记抗体时死细胞容易发生非特异性染色的缘故。基于此,我们也可以利用这个特性来帮助我们鉴别死细胞,目前有两个方法-----使用DNA染料或蛋白染料。

  1. DNA结合染料

  PI、DAPI、7-AAD等DNA染料利用死细胞膜通透性增大、不破膜的情况下DNA染料即可进入的特点区分出死细胞,且所用染料浓度、时间远远低于细胞周期所用的浓度,并且不需要固定。

  PI检测通道:使用488 nm激发,用610/20 BP收集;

  DAPI检测通道:最好用355nm激发,用440/40BP收集;也可以用405nm激发,450/50BP收集;

  7-AAD检测通道:用488nm激发,用670/14BP收集;

  染色方法:

  1. 用0.5ml 1×PBS重悬细胞。

  2. 加入PI或DAPI或7-AAD,终浓度分别为PI(5 µg/ml)、DAPI(500-1000 ng/ml)、7-AAD(2.5 µM)

  3. 加入上述染料后,尽快上机,一般不要超过5分钟(有些厂家说明书写着10分钟,可能与浓度有关,可按照说明书操作)。

  在上面的步骤中是把染料直接加入活细胞标本中。如果将PI等加入经过固定的细胞中会使所有的细胞都发生渗透性增高,结果就是所有的细胞都染上PI。在一些需要检测胞内抗原而不得不破膜的标本中,这时就没法用PI等DNA染料来区分死细胞了。

  2. 蛋白结合染料

  蛋白结合染料有时候又被称为胺类反应性染料或live/dead可固定染料。它们也是基于死细胞胞膜受损的原理,但略有不同,它们不是结合到DNA,而是结合到蛋白质,这类染料需要在固定前加入样本中。活细胞由于细胞表面有少量蛋白,所以会结合少量的蛋白染料,而死细胞由于染料可以进入细胞内,能够结合大量的胞内蛋白质,荧光会特别强。

  染色完成之后,细胞就可以用多聚甲醛或乙醇等进行固定了,固定之前的死、活细胞之间的染色水平差异会一直保留着。这种染色方法也非常简单,只需样本和染料直接孵育20分钟,而且这类染料的激发和发射特性也很多,所以能挑选到一种适合你实验的荧光标记蛋白结合染料。

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