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贴壁细胞的冻存和复苏的具体步骤

2023-02-12 10:33:20
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  贴壁细胞冻存实验准备:

  将15mL离心管、冻存管、PBS缓冲液、移液管、电动移液器等物品提前放入生物安全柜中,紫外照射30min消毒灭菌;

  细胞完全培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、细胞冻存液等从4℃冰箱中取出后,复温至室温,备用;程序降温盒复温至室温备用。

  贴壁细胞冻存操作步骤:

  1. 从培养箱中取出准备冻存的细胞;

  2. 显微镜下观察细胞状态并拍照记录;

  3. 酒精消毒培养瓶后放入安全柜中;

  4. 吸去多余的培养基,加人2~3ml PBS缓冲液润洗一次;

  5. 加入1ml胰酶,放入37℃消化;

  6. 消化1min左右,在显微镜下观察细胞消化情况;

  7. 消化完全后,加3ml完全培养基终止;

  8. 将细胞悬液移入15ml离心管中离心,1000rpm/min(约200g)离心3-5min;

  9. 吸去多余的液体,向细胞沉淀中加入适量的冻存液,轻轻吸打混匀;

  10. 按比例分装至冻存管中;

  11. 贴好标签后放入梯度冻存盒中;

  12. 将冻存盒放入-80℃,降温过夜后,移入液氮中保存。

  注意事项:

  1)细胞冻存液需提前配制,不可直接将DMSO加入细胞悬液中;

  2)不同细胞消化时间有差异,以实际镜检结果为准,大部分细胞回缩变圆并有少量细胞脱落即可中止消化,消化时间不宜过长;

  3)应选择汇合度80%-90%左右,细胞处于对数生长期时进行冻存操作,确保细胞冻存时状态最佳,冻存密度可根据细胞特性进行调整;

  4)冻存细胞保存温度应低于-130℃,不可在-80℃长期保存。

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