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细胞冻存和复苏操作步骤

2023-02-13 10:29:01
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  原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后,经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群,使之在体外模拟人体生理环境,在无菌、适当温度和一定的营养条件下,生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分,生长缓慢,但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验,如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。

  1、冻存细胞:

  (1)选对数增生期细胞(证明无支原体污染),在冻存前1d换液。

  (2)按常规方法把培养细胞制备成悬液,计数,使细胞密度达5×10^7/ml左右密度,离心,去上清。

  (3)加入配制好的冻存液(培养液6.8ml,小牛血清2ml,DMSO 1ml,5.6%NaHCO3 0.1ml),按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中,然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10%二甲基亚砜(DMSO) 或甘油,可使冰点降低,使细胞内水分在冻结前透出细胞外。

  (4)分装于无菌冻存管中,每管加1.5m悬液。

  (5)旋好冻存管并仔细检查,一定要盖紧,做好标记。

  (6)冻存:在特殊的仪器或简易的液氮容器中,按-1℃/min的速度,在30~40min时间内,下降到液氮表面,再停30min后,直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度,过快能影响细胞内水分透出,太慢则促进冰晶形成。

  操作时应戴防护眼镜和手套,以免液氮冻伤。

  2、复苏细胞:

  (1)从罐中取出冻存管。

  (2)迅速放入36℃~37℃水浴,不时摇动,使其急速融化,30~60s内完成。

  (3)冻存管用70%酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加10ml培养液。

  (4)低速离心(500~1000r/min) 5min,去上清后再用培养液洗一次。

  (5)用培养液适当稀释后,装入培养瓶37℃培养,次日更换一次培养液后,继续培养。以后仍按常规进行培养。

  冻存细胞数量要充分,密度应达到107/ml,在融后稀释20倍时,仍能保持5×105/ml数量。

  细胞的冻存和复苏,让某些细胞可以保存到现在。

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